A Bacillus subtilis étrend-kiegészítése befolyásolta az elválasztott sertések bél egészségét
Absztrakt
Háttér
Egyre több bizonyíték támasztja alá a közvetlenül táplált mikrobák (DFM) kiegészítésének az elválasztott sertések teljesítményére, egészségi állapotára és immunválaszaira gyakorolt jótékony hatásait. Ezért ennek a tanulmánynak a célja az étrend-kiegészítők vizsgálata volt Bacillus subtilis (DSM 25841) a patogén F-18-mal kísérletileg fertőzött elválasztott sertések növekedési teljesítményéről, hasmenéséről, bélpermeabilitásáról és immunitásáról Escherichia coli (E. coli).
Eredmények
Az F18 E. coli fertőzés csökkent (
Háttér
Az elválasztás utáni hasmenés óriási gazdasági veszteségeket okoz a sertésiparban a halálozás és morbiditás, a fogyás és a gyógyszerköltség miatt [1, 2]. Enterotoxigén Escherichia coli (E. coli) a fertőzés továbbra is az elválasztás utáni hasmenés egyik legfontosabb oka a sertésekben. Az elmúlt évtizedekben az antibiotikumokat erőteljes összetevőként alkalmazták az elválasztás utáni hasmenés megelőzésére E. coli fertőzés. A takarmányokban lévő antibiotikumok termelési célú felhasználását azonban az állattenyésztési iparban teljesen megtiltották az USA-ban és az EU-ban [3], ami jelentősen növeli a sertések egészségének megőrzésével járó kihívásokat, különösen az elválasztás utáni időszakban. Így minden olyan megbízható stratégia, amely növelheti a betegségekkel szembeni ellenállást és az elválasztott sertések termelését, jelentős előnyökkel jár az ipar számára [4, 5].
Anyagok és metódusok
Állatok, szállás, kísérleti tervezés és étrend
Klinikai megfigyelések és mintagyűjtések
Β-hemolitikus coliformok kimutatása
Röviden: székletmintákat vittünk a Columbia Blood Agar-ra 5% juhvérrel, hogy azonosítsuk a hemolitikus coliformokat, amelyek lizálják a kolóniát körülvevő vörösvérsejteket. Székletmintákat is telepítettünk MacConkey agarra az összes coliform felsorolásához. A véragar hemolitikus telepeit MacConkey-agaron tovább tenyésztettük, hogy megerősítsük, hogy laktózt fermentáló baktériumok és lapos rózsaszínű telepek voltak. Az összes lemezt 37 ° C-on inkubáltuk 24 órán át egy levegő-inkubátorban. Mind a teljes, mind a β-hemolitikus koliformok populációit a véragaron vizuálisan értékeltük, 0 és 8 közötti pontszámmal (0 = nincs baktériumnövekedés, 8 = nagyon nehéz baktériumnövekedés). Kiszámítottuk a β-hemolitikus coliformok és az összes coliformok arányát. A kérdéses telepeket új MacConkey és véragar lemezeken szubkultúrázták, hogy ellenőrizzék, β-hemolitikusak-e E. coli hármas cukor-vas-agar és lizin-vas-agar használatával, és annak igazolására, hogy ezek F-18-at tartalmaznak-e+ E. coli PCR alkalmazásával [21].
Béláteresztés elemzése Ussing kamrával
A bélpermeabilitás elemzésének eljárásai a korábban publikált módszereket követték [22]. A szöveteket egy Ussing kamrába (Physiological Instruments, San Diego, Kalifornia) szereltük fel, miután a hosszanti izomtól megfosztották és a mesenterialis határ mentén kinyitották. A kamra a szövet felületét (0,5 cm2) 2,5 ml oxigénezett Krebs-mannitol (10 mmol/l) és Krebs-glükóz (10 mmol/l) hatásának tette ki 37 ° C-on, a luminális és a szerozális oldalon. 30 perces egyensúlyi periódus után mértük a rövidzárlati áramot és a vezetőképességet. A transzcelluláris és a paracelluláris permeabilitást a torma-peroxidáz (HRP) és a FITC-4000 (FD-4) fluxusának mérésével határoztuk meg a jejunális nyálkahártyán. HRP-t (0,5 mg) és FD-4-et (1 mg) adtunk a nyálkahártya kamrájához, és 200 µL mintát gyűjtöttünk a szerosális kamrából 30 percenként 1 órán át. A kamrákon belüli állandó térfogat fenntartása érdekében minden mintapontban ekvivalens térfogatú Krebs-glükóz-oldatot cseréltek ki. O-dianizidin-peroxidáz szubsztrátumot használtunk a HRP detektálására 450 nm abszorbanciánál. Az FD-4 koncentrációját fluoreszcenciával mértük 485 nm gerjesztésnél és 538 nm emissziónál.
A bél morfológiája
A rögzített bélszöveteket paraffinba ágyazottuk, 5 μm-nél metszettük, és magas vas-diaminnal és alcian-kékkel festettük. A tárgylemezeket a NanoZoomer Digital Pathology System (Hamamatsu Co., Bridgewater, NJ) szkennelte, és az összes mérést a hozzá tartozó dia-néző szoftverrel (NDP.view; Hamamatsu Co.) és képfeldolgozó és elemző szoftverrel (Image J, NIH, NEMZETI EGÉSZSÉGÜGYI INTÉZET). Tizenöt egyenes és integrált villit és a hozzájuk tartozó kriptákat és a körülvett területet választottuk ki a villi magasságának, a kriptamélységének, a villára jutó serlegsejtek számának és a szulfo- és szialomucin keresztmetszeti területének elemzésére, amint azt Deplancke és Gaskins leírják [23] és Almeida és mtsai. [19].
Kvantitatív valós idejű PCR
Statisztikai analízis
Az adatok normalitását az UNIVARIATE eljárás segítségével (SAS Inst. Inc., Cary, NC) azonosítottuk és a bélpermeabilitásra és a hasmenés gyakoriságára várható összes adatot kiszámítottuk. Ugyanakkor nem észleltek kiugrást és nem távolítottak el az adatkészletből. A növekedési teljesítmény, a hasmenés pontszám, a bélpermeabilitás és a génexpresszió szempontjából az adatokat ANOVA-val elemeztük, a SAS PROC MIXED alkalmazásával, randomizált, teljes blokktervezéssel, disznóval mint kísérleti egységgel. A statisztikai modell a kezelést szerepeltette fő hatásként, a blokkokat pedig véletlenszerű hatásként. A kezelési eszközöket az LSMEANS utasítás és a PROC MIXED PDIFF opciójának felhasználásával választottuk el. Kontraszt állításokkal teszteltük a Bacillus subtilis összehasonlítva a pozitív kontrollal. A hasi gyakoriság elemzésére a khi-négyzet tesztet használtuk. A statisztikai szignifikanciát és tendenciát a
Eredmények
Növekedési teljesítmény, hasmenés pontszám, β-hemolitikus coliformok
A sertések kezdeti testtömegében nem tapasztaltunk különbséget az étrendi kezelések között (2. táblázat). A negatív kontroll sertésekkel összehasonlítva a pozitív kontroll csoport sertései csökkentették a BW értéket a d 5 PI-n ( 2. táblázat Az elválasztott sertések növekedési teljesítménye kiegészítve Bacillus subtilis
A negatív kontrollhoz képest F18 E. coli kihívás nőtt ( 1. ábra
A negatív kontrollcsoport sertéseinek székletében nem észleltünk β-hemolitikus coliformokat (2. ábra). Sertések a pozitív kontrollban, alacsony és nagy dózisban Bacillus subtilis csoportban magasabb volt ( 2. ábra
Béláteresztés és bélmorfológia
F18 E. coli kihívás nőtt ( 3. ábra
E. coli a kihívás is csökkent ( 4. táblázat A gének relatív mRNS-expressziója az elválasztott sertések jejunális nyálkahártyájában Bacillus subtilis
E. coli szabályozott kihívás ( 5. táblázat A gének relatív mRNS-expressziója az elválasztott sertések ileum nyálkahártyájában, kiegészítve Bacillus subtilis
Vita
F18 E. coli-az indukált hasmenés az elválasztott sertések morbiditásának és mortalitásának gyakori oka [26]. A jelenlegi tanulmányban feltárt eredmények azt mutatják, hogy a Bacillus subtilis javult növekedési sebesség, csökkent béláteresztés és módosíthatja az F18-mal kísérletileg fertőzött elválasztott sertések bélrendszerét E. coli. Ezek az eredmények összhangban vannak a korábban publikált kutatásokkal, amelyek a különböző törzsekkel táplált malacok növekedési teljesítményének és egészségi állapotának javulását mutatják Bacillus subtilis [27,28,29]. Az ezekhez az előnyökhöz kapcsolódó lehetséges mechanizmusok a következőket tartalmazhatják, de nem korlátozódnak ezekre: 1) a Bacillus subtilis (DSM 25841) javította a bél integritását azáltal, hogy fokozza a bélgát funkcióját és csökkenti a bél áteresztőképességét a jejunumban; 2) kiegészítése Bacillus subtilis az elválasztott sertések szabályozott bélimmunitása; 3) a Bacillus subtilis modulálta a bél mikrobiomját és metabolitjaikat. A mostani kísérlet inkább az első potenciális mechanizmusra koncentrált.
A sok potenciális jelölt egyikeként, hogy részben pótolja a takarmányban lévő antibiotikumokat, Bacillus subtilis sok figyelmet keltettek, mivel hőstabilak a takarmány feldolgozása során, és képesek átadni potenciális előnyeiket a vékonybélben/vastagbélben, miután túlélik a gyomorban alacsony pH-értéket [5]. A bejelentett hatásai Bacillus subtilis az elválasztott sertések hasmenésének előfordulásáról nem következetesek. Példaként Bhandari et al. [37] és Hu és mtsai. [15] feltárta, hogy Bacillus subtilis csökkent az elválasztott sertések hasmenése akár egy K88-ban E. coli kihívástanulmány vagy normál lakhatási körülmények között, de ez nem volt így a Giang et al. [38]. Bár kiegészítése Bacillus subtilis nem csökkentette a hasmenés gyakoriságát E. coli A jelen vizsgálatban a disznókkal fertőzött sertéseket ezután fokozta az elválasztott sertések növekedési ütemét és takarmányhatékonyságát E. coli fertőzés. Ezek a megfigyelések egyértelműen jelzik a Bacillus subtilis elősegítette az elválasztott sertés teljesítményét valószínűleg más mechanizmusok révén. Utánkövetési kísérlet folyik a bélpermeabilitás és az általános hasmenés pontszám közötti összefüggés feltárására további mintavételi pontok hozzáadásával és a kísérleti időszak meghosszabbításával.
Más potenciális mechanizmusok is kapcsolódhatnak a táplálékkal megnövekedett növekedési sebességhez Bacillus subtilis. Mint például, Bacilus-alapú DFM javíthatja az elválasztott sertések növekedési teljesítményét az energia és a tápanyagok emészthetőségének javításával [29, 54]. Különösen, Bacilus-alapú DFM növelheti a rostbontást a sertések bélrendszerében [11, 55]. Bacilus-az alapuló DFM-kiegészítés szintén növelheti a bélrendszerben található hasznos mikroorganizmusok populációját, amelyek versenyeztetik a tápanyagokat és a kötődési helyeket a kórokozókkal, ezáltal csökkentve a kórokozók szaporodását [56]. További kutatások szükségesek az itt felsorolt lehetséges hatásmódok vizsgálatához.