A határok diszlipidémiás étrendje perifériás neutrofilek és monociták mobilizálódását idézi elő

Nem neuronális sejtek

Ez a cikk a kutatási téma része

Immunválaszok neurológiai rendellenességekben: A komplex interakciós hálózat, amely összeköti a mikroglia, az asztrocitákat és a betolakodók immun perifériás sejtjeit Az összes 15 cikk megtekintése

Szerkesztette
Albert Giralt

Barcelonai Egyetem, Spanyolország

Felülvizsgálta
Seong-Woon Yu

Daegu Gyeongbuk Tudományos és Technológiai Intézet (DGIST), Dél-Korea

Francesc Miro

Institut de Recerca Biomèdica August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Spanyolország

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

perifériás

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Neurológiai Tanszék, Tianjin Neurológiai Intézet, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin, Kína
  • 2 A központi idegrendszeri neuro-helyreállítás és regeneráció legfontosabb laboratóriuma, Tianjin Neurológiai Intézet, Oktatási Minisztérium, Tianjin, Kína
  • 3 Neurológiai Betegségek Központja, Datong harmadik népkórháza, Shanxi, Kína
  • 4 Kína Neurológiai Betegségek Országos Klinikai Kutatóközpontja, Peking Tiantan Kórház, Capital Medical University, Peking, Kína
  • 5 Fejlett emberi agyvédelmi innovációs központ, Capital Medical University, Peking, Kína
  • 6 Pekingi agyi és érrendszeri betegségek transzlációs orvoslásának legfontosabb laboratóriuma, Peking, Kína

Háttér: Az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) egy gyakori májbetegség, amelyet a lipidek jelentős felhalmozódása jellemez a májban túlzott alkoholfogyasztás nélkül. A felhalmozódó bizonyítékok arra utalnak, hogy a NAFLD betegeknél jelentősen megnő az intracerebrális vérzés (ICH) kockázata. Azt azonban továbbra sem lehet pontosan tudni, hogy a NAFLD befolyásolja-e és hogyan befolyásolja a vérzéses agysérülés kimenetelét. Itt megvizsgáltuk a diéta által kiváltott NAFLD hatásait az egerek ICH sérülésére és neuroinflammációjára.

Mód: A NAFLD-t C57BL/6 egerekben indukálták metionin-kolinhiányos (MCD) diétával 4 héten keresztül. Kollagenázt és autológ vérmodelleket alkalmaztunk a NAFLD ICH sérülésre és neuroinflammációra gyakorolt ​​hatásainak értékelésére.

Eredmények: A 4 hétig tartó MCD-diéta NAFLD-t és hiperlipidémiát vált ki egerekben. Az MCD-diétát kapó egerek súlyosbítják az ICH után fellépő neurológiai hiányokat és agyi ödémát. Az ICH sérülés fokozódása a neutrofilek és monociták agyi infiltrációjával és a gyulladásgátló tényezők fokozott termelésével járt együtt. Az ICH előtt az MCD diéta által kiváltott neutrofilek és monociták mobilizálása a periférián. Nevezetesen, a NAFLD ICH sérülésre gyakorolt ​​káros hatása megszűnt azokban az egerekben, akik neutrofilek és monociták antitest-kimerülésében részesültek.

Következtetések: Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a NAFLD súlyosbítja az ideggyulladást és az ICH sérülést.

Bevezetés

Az intracerebrális vérzés (ICH) súlyos típusú stroke, hatékony kezelés nélkül (Aronowski és Zhao, 2011). Epidemiológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a környezeti és étrendi tényezők összefüggenek az ICH utáni incidenciával és kimenettel. Az ICH kockázatát növelő tényezők közül az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) egy olyan gyakori májbetegség, amely az általános populáció akár 30% -át is érinti (Tsochatzis és Newsome, 2018). A NAFLD-t a lipidek túlzott mértékű lerakódása jellemzi a máj parenchymájában, függetlenül a nehéz alkoholfogyasztástól (Kim és mtsai., 2011; Younossi és mtsai., 2018; Khoury és mtsai., 2019). A májzsír felhalmozódása mellett a betegek általában inzulinrezisztenciát, diszlipidémiát és fokozódó szisztémás gyulladást mutatnak (Gluchowski et al., 2017; Fiorucci et al., 2018). Azonban továbbra is megfoghatatlan, hogy a NAFLD befolyásolja-e és hogyan befolyásolja az ICH eredményét.

Az új bizonyítékok a gyulladást kulcsfontosságú elemként igazolták, amely hozzájárul az ICH utáni másodlagos agysérüléshez (Zhou és mtsai, 2014). Az ICH ictusát követően a vérkomponensek, beleértve a leukocitákat is, az agyba jutnak, aktiválják a rezidens glia-t, és toboroznak immunsejteket, például neutrofileket és monocitákat (Mracsko et al., 2014; Sheth és Rosand, 2014; Zhang Z. et al., 2017) . Ezek a gyulladásos események felgyorsítják a perihematomális ödéma és a neurológiai romlás kialakulását (Haukeland és mtsai, 2006; Farrell és mtsai, 2012; Gao és Tsukamoto, 2016). Klinikai vizsgálatok azt mutatták, hogy a NAFLD-ben szenvedő betegeket a szisztémás gyulladás fokozódása jellemzi, amelyet a keringő gyulladásos sejtek fokozott mobilizációja jellemez, ami arra utal, hogy a NAFLD esetleg perifériás immunsejtek mobilizálását indukálja. Mégis, az ilyen mobilizáció hatása az ICH-ra adott kóros válaszokra ismeretlen. E kérdés megválaszolására az egerek metionin-kolinhiányos (MCD) diétával történő etetésével indukáltuk a NAFLD-t, és két ICH modell segítségével megvizsgáltuk a NAFLD hatásait a vérzéses sérülésekre és a neuroinflammációra.

Anyagok és metódusok

Állatok

A kísérleti protokollokat a Tianjin Orvostudományi Egyetem Általános Kórházának intézményi állatgondozási és felhasználási bizottságai hagyták jóvá. Valamennyi kísérletet az ARRIVE (Animal Research: report of in vivo Kísérletek) irányelvek. A hím C57BL/6 egereket (12 hetesek) a Vital River Corporation-től (Peking, Kína) vásároltuk. Az egereket kórokozóktól mentes körülmények között helyezték el, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez. Az egereken végzett összes műtétet altatásban végezték. Az összes egeret véletlenszerűen rendeltük hozzá az egyes kísérletekhez.

ICH indukció egerekben

Mint arról korábban beszámoltunk, az ICH egerekben autológ vér vagy bakteriális kollagenáz injekciójával indukálódott (Li és mtsai, 2017a, b; Ren és mtsai, 2018). Először az egereket ketamin (100 mg/kg) és xilazin (10 mg/kg) intraperitoneális injekcióval altattuk. Miután az egereket egy sztereotaktikus keretre helyezte, a koponya jobb oldalán 1 mm-es sorjafuratot fúrtak (2,3 mm-re a középvonal felé, 0,5 mm-rel elöl a bregma felé). A kollagenáz ICH modellhez 0,0375U baktérium-kollagenázt (IV-S típusú, Sigma, St. Louis, MO, USA) 0,5 μl sóoldatban oldva infúzióval infúziós pumpával ( Kd Scientific Inc., Holliston, MA, USA) 0,5 μl/perc sebességgel. Néhány kísérletben kettős injekciós módszerrel indukáltuk az egér ICH modellt autológ vér infúziójával. A teljes vért (30 μl) kivették a szögletes vénából, majd az agyba infundálták a korábban leírtak szerint (Sun és mtsai, 2016). Először 5 μl vért fecskendeztek be, hogy a lyuk alatt 3 mm mélyen alvadék keletkezzen. Ezután a tűt 3,5 mm mélyre mozgattuk, hogy a maradék 25 μl vért 1 μl/perc sebességgel injektáljuk. A műtét után az állatokat ketrecbe helyezték, és szabad hozzáférést biztosítottak az élelemhez és a vízhez.

Tanulmányterv és gyógyszeradminisztráció

Ebben a vizsgálatban összesen 207 hím C57BL/6 egeret alkalmaztunk. Az egereket véletlenszerűen osztották be az egyes csoportokba az adott chow típusa szerint. Metionin-kolinhiányos (MCD) étrendet (H10401, Beijing HFK Bioscience Company Limited) 4 hétig tápláltunk a NAFLD állati modelljének előállításához az ICH indukció előtt. A normál étrendet tápláló egereket használtuk kontrollként. Ez az adminisztráció a kísérlet végén is fennmaradt (Larter és Yeh, 2008; Zhang és mtsai, 2014). Az egér ICH modelljét kollagenáz vagy autológ vér infúziójával indukáltuk a 0. napon. Az ICH után meghatározott időpontokban egy sor értékelést végeztünk. A Gr-1 + sejt depléciós kísérlethez anti-egér Gr-1 monoklonális antitestet (MAb-RB6-8C5; BioXcell, Nyugat-Libanon, NH, USA) intraperitoneális injekcióval adtunk be 1 nappal az ICH indukció előtt és egy nappal azután. egérenként 250 μg dózis (Condamine et al., 2014; Wang et al., 2015). A Gr-1 + sejtek több mint 90% -a kimerült egerekben anti-egér Gr-1 monoklonális antitestet kapott. Az összes adatot független kutatók elemezték, akik megvakultak a csoport kijelölésével szemben.

Viselkedésértékelés

A viselkedésértékelést az ICH műtét után meghatározott időpontokban végeztük, hogy értékeljük a motoros, érzékszervi, reflex és egyensúly funkciókat. A módosított Neurológiai Súlyossági Pontszám (mNSS), sarokfordulási teszt, valamint a lábtörés-teszt a korábbiakban leírtak szerint történt (Clarkson et al., 2010; Klebe et al., 2017; Ren et al., 2018). Az mNSS pontszámtartománya 0 és 18 között van, és az egerek 1 pontot kaptak azért, mert képtelenek voltak egy feladatot teljesíteni. A szögmotoros tesztet használtuk a szenzomotoros és a testtartási aszimmetriák értékelésére. Röviden, mindegyik egér szabadon halad egy 30 fokos szögű sarokba, majd jobbra vagy balra fordul, hogy kilépjen. Ezt a feladatot 10-szer megismételtük, legalább 30 másodperces időközökkel a vizsgálatok között. A jobb kanyarok százalékát kiszámoltuk és feljegyeztük. A lábtörés-teszthez az egereket egy 32 mm × 20 cm × 50 cm (hosszúság × szélesség × magasság) méretű rácsberendezésre helyezték, 12 mm-es hálóval, és 5 percig hagyták szabadon barangolni. Lábhibát definiáltak, amikor az egér végtagját a rácslyukba dobta, vagy a rácsral a csukló szintjén pihent. A lábhibák százalékát a következő képlet alapján számoltuk ki: lábhibák/(lábhiba + láb nélküli hibalépések) × 100.

Az agy víztartalmának mérése

Az agy víztartalmát a 3. napon értékeltük az ICH indukció után, a korábban leírtak szerint (Han és mtsai, 2017). Röviden: az egerek agyát perfúzió nélkül eltávolítottuk, és három részre boncoltuk: az ipsilaterálisra, az contralaterálisra és a cerebellumra. Az összegyűjtött szöveteket azonnal lemértük, hogy nedves súlyokat kapjunk, majd 24 órán át 100 ° C-on szárítottuk, hogy száraz súlyokat kapjunk. A víztartalom százalékát a következő képlettel számoltuk: (nedves tömeg-száraz tömeg)/nedves tömeg × 100%.

Áramlási citometria

Valós idejű polimeráz láncreakció

Három nappal az ICH indukció után a teljes RNS-t kivontuk az agyszövet ipsilaterális féltekéjéből Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) felhasználásával a gyártó utasításai szerint. Az RNS koncentrációját ultraibolya spektrofotometriával mértük 260/280 nm-en. Ezután a teljes RNS-t reverz átírással cDNS-be írtuk át a PrimeScript ™ RT reagenskészlet (TaKaRa, Shiga, Japán) felhasználásával. Minden eljárást az utasításoknak megfelelően hajtottak végre. SYBR Green PCR Master Mix-et (Roche, Indianapolis, IN, USA) alkalmaztunk a génszekvenciák amplifikálására az Opticon 2 Real-Time PCR detektáló rendszeren (BioRad, Hercules, CA, USA). Az ebben a kísérletben használt primereket az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza. A GAPDH szolgált referencia génként, és az mRNS expresszióját a 2 -ΔΔCt módszer alkalmazásával számítottuk szeres változásokként. Az ebben a vizsgálatban az RT-PCR elemzéshez használt primer szekvenciákat az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza.

A BBB permeabilitásának értékelése

Az ICH utáni 3. napon a BBB permeabilitását Evans Blue (Sigma, St. Louis, MO, USA) extravazáció mennyiségi meghatározásával mértük, a korábban leírtak szerint (Zhang Y. et al., 2017; Ren et al., 2018). Evans Blue-t (2% sóoldatban, 4 ml/kg) injektáltunk a farokvénán 2 órával az agy összegyűjtése előtt. az egereket 10% klór-hidráttal altattuk és PBS-sel perfundáltuk. Lefejezés után az agyakat eltávolítottuk és megpucoltuk. A szöveteket ezután kvalitatív elemzés céljából lefényképezték. A kvantitatív elemzéshez az agyszöveteket eltávolítottuk, lemértük és dimetil-formamidba helyeztük. Homogenizálás után az elegyet 72 órán át 60 ° C-os vízfürdőben inkubáltuk, és 1500 ° C-on centrifugáltuk. g 10 percig. A felülúszó abszorbancia értékét fluoreszcencia spektrofotométerrel mértük. Az Evans Blue szövettartalmát lineáris standard görbéből számszerűsítettük.

Hematoxilin és eozin (H&E) folt, olajvörös O folt

Miután az egerek 4 hétig MCD diétát vagy kontroll étrendet kaptak, a májszöveteket összegyűjtöttük és 4% paraformaldehid alkalmazásával rögzítettük. Ezután 8 μm vastag metszeteket készítettünk mikrotommal (Leica Biosystems, Nussloch, Németország). A viaszmentesítés és a hidratálás után a szövetszakaszokat H&E-vel festettük egy kereskedelmi készlet (Solarbio, Peking, Kína) felhasználásával. Mikroszkópos képeket kaptunk mikroszkóp segítségével (Olympus, Tokió, Japán). Az Oil Red O festéshez a rögzített májszöveteket OCT-be ágyazottuk, és 8 μm vastag szakaszokra szeleteltük. Desztillált vízzel végzett mosás után a szeleteket 60% izopropil-alkoholban áztattuk 20-30 másodpercig. Ezután a szeleteket egy módosított olajvörös O festőoldattal (G1261, Solarbio Life Sciences) töltött festéktartályba helyeztük, és 10-15 percig sötétben festettük. Szétválasztás és mosás után a szeleteket 1-2 percig hematoxilin oldattal ellenfestettük, hogy feltárjuk a magokat. Végül a szeleteket megfigyelés céljából a glicerin zselatinnal szereltük fel.

A triglicerid (TG) értékelése

A szérumban és a májban lévő lipideket a triglicerid assay kit (A110-2-1, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína) kézikönyvének megfelelően mértük. A szérum- és májminták trigliceridjét (TG) enzimatikus kolorimetriás GPO-PAP módszerrel becsültük meg. Az egész vért centrifugáltuk a szérum elválasztására. A májszövet esetében a felülúszót centrifugáltuk és homogenizálás után összegyűjtöttük. A mintát összekeverjük a munkaoldattal és 10 percig inkubáljuk 37 ° C-on. Az abszorbanciát 510 nm-en mértük. A triglicerid tartalmát a standard és a minta abszorbanciaértékének kiszámításával mértük.

Alvadási idő és vérzési idő mérése

Az egerek alvadási idejének felméréséhez érzéstelenítés után vért vettünk a szögvénából üvegkapilláris segítségével. Ezután a vérrel töltött csövet egy lapos tetejére tették. A kapilláriscső azonos hosszúságát 30 másodpercenként feltörtük, amíg egy fibrinszál kialakult. Ami az egerek vérzési idejét illeti, szikepengével használtuk a farok átmetszését a hegytől 2 mm-re. A farokot átlátszó, sóoldattal töltött csőbe merítettük 37 ° C-on. A vérzési időt a vérzés megszűnéséig definiáltuk. A maximális megfigyelési idő 20 perc volt. Ha 30 másodpercen belül nem volt vérzés, akkor azt leállítottnak tekintették.

Statisztikai analízis

A minta nagyságát teljesítményanalízissel határoztuk meg, a szignifikáns különbségek értékeléséhez 80% -os teljesítménnyel α = 0,05 szignifikanciaszintet alkalmaztunk. A teljesítményelemzést és a minta méretének kiszámítását SAS 9.1 szoftver (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) segítségével végeztük el. Az adatokat legalább két kutató elemezte, akik megvakultak a csoportos hozzárendelésre. Valamennyi érték átlag ± SD értékként jelenik meg. A statisztikai elemzéseket Graphpad 6.0 szoftverrel végeztük. A párosítatlan 2-farkú Student's t-tesztet használtunk a két csoport közötti különbségek szignifikanciájának meghatározására, és a túlélési indexet Log-rank (Mantel-Cox) teszttel elemeztük. magas CD11b + Ly6G +) és monociták (CD45 magas CD11b + Ly6G - Ly6C magas) szignifikánsan megnőttek a NAFLD egerekben a kontroll egerekhez képest az ICH utáni 3. napon, de a mikroglia és a limfociták, köztük a T-sejtek és a B-sejtek, nem különböztek szignifikánsan ezek között két csoport (3A – C. ábra). Ezenkívül az RT-PCR adatok azt mutatják, hogy a NAFLD az ICH után az ipsilaterális féltekén is növelte az IL-1β, CCL2, CXCL2 és MMP9 mRNS-szintjét, ezeknek a géneknek a többsége összefügg a mieloid sejtek beszivárgásával és működésével (3D ábra).

6. ábra. A myeloid sejtekből kimerült ICH egerekben a NAFLD káros hatása megszűnt. (A) A folyamatábra szemlélteti a gyógyszer beadását és a kísérlet tervezését. A NAFLD-t vagy a kontroll egereket anti-Gr-1 mAb-vel vagy IgG-vel kaptuk 1 nappal az ICH előtt és egy nappal azután. Az ICH előtt és az ICH utáni 1. és 3. napon értékelték a neurológiai hiányokat és az agy víztartalmát. (B) Az egerek agyi víztartalmának eredményei az ICH után a 3. napon jelzett kezeléseket jeleztek. = 10 csoportonként. (C) A neurológiai hiányosságok felmérésének statisztikai adatai, beleértve az mNSS-tesztet, a sarokfordulási tesztet és a lábhiba-teszt pontszámát a jelzett egércsoportokban. = 10 csoportonként. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. * Kulcsszavak: intracerebrális vérzés, NAFLD, ideggyulladás, mieloid sejtek, immunválasz

Idézet: Li X, Cheng X, Wang X, Liu Q, Ma H és Li M (2020) A diszlipidémiás étrend a perifériás neutrofilek és monociták mobilizációját indukálja, amelyek súlyosbítják a vérzéses agysérülést és a neuroinflammációt. Elülső. Sejt. Neurosci. 14: 154. doi: 10.3389/fncel.2020.00154

Beérkezett: 2020. február 28.; Elfogadva: 2020. május 11 .;
Publikálva: 2020. június 08.

Albert Giralt, Barcelonai Egyetem, Spanyolország

Francesc Miro, August Pi i Sunyer Orvosbiológiai Kutatóintézet (IDIBAPS), Spanyolország
Seong-Woon Yu, Daegu Gyeongbuk Tudományos és Technológiai Intézet (DGIST), Dél-Korea