A határok ketogén étrendje javítja az agyi iszkémiás toleranciát és gátolja az NLRP3 gyulladásos betegségét

Szerkesztette
Andrej Szurgucov

Kansas Egyetem Orvosi Központ, Egyesült Államok

Felülvizsgálta
David Ruskin

Trinity College, Egyesült Államok

Mustapha U. Imam

Zhengzhou Egyetem, Kína

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

javítja

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Neurológiai Osztály, Huashan Kórház, Fudan Egyetem, Sanghaj, Kína
  • 2 Neurológiai Osztály, Sanghaji Tizedik Népkórház, Tongji Egyetem, Sanghaj, Kína
  • 3 Állami Géntechnikai Laboratórium, Genetikai és Fejlesztési Együttműködési Innovációs Központ, Élettudományi Iskola, Fudan Egyetem, Sanghaj, Kína
  • 4 Fudani Egyetem Taizhou Egészségtudományi Intézete, Taizhou, Kína

Háttér: A stroke-modellekben beszámoltak a ketogén étrendek (KD) neuroprotektív hatásairól, és a stroke patogenezisében a nukleotid-kötő doménhez (NOD) hasonló receptor fehérje 3 (NLRP3) gyulladásos sejtek is bekapcsolódtak. Ennek a tanulmánynak a célja a KD NLRP3-gyulladásra gyakorolt ​​hatásainak vizsgálata és a lehetséges molekuláris mechanizmusok feltárása volt.

Mód: Ban ben in vivo vizsgálatban az egereket 3 hétig KD-vel etették, majd középső agyi artéria elzáródás/reperfúzió (MCAO/R) sérülésnek vetették alá. Ban ben in vitro vizsgálat során az SH-SY-5Y sejteket β-hidroxi-butiráttal (BHB) kezeltük, majd oxigén – glükóz-nélkülözés/reoxigenáció (OGD/R) következett. Kiértékeltük az NLRP3 gyulladásos aktivációját és a kapcsolódó szabályozási mechanizmusokat.

Eredmények: A KD-vel táplált egereknél nagyobb volt a tolerancia az MCAO/R iránt. A KD gátolta az endoplazmatikus retikulum (ER) stresszt és elnyomta a TXNIP/NLRP3 gyulladásos aktiválódását az agyban. A in vitro tanulmány kimutatta, hogy a BHB (10 mM) megakadályozta a dinaminnal kapcsolatos protein 1 (Drp1) mitokondriális transzlokációját a mitokondriális hasadás gátlásában. Továbbá a BHB csökkentette a reaktív oxigénfajok (ROS) képződését, gátolta az OGD/R-vel kezelt sejtekben az ROS-NLRP3 útvonalat, és elnyomta az ER stressz okozta NLRP3 gyulladásos aktiválódását.

Következtetések: A KD elnyomhatja az ER stresszt és megvédi a mitokondriális integritást azáltal, hogy elnyomja a Drp1 mitokondriális transzlokációját, hogy gátolja az NLRP3 gyulladásos aktivációját, és ezzel neuroprotektív hatásokat fejtsen ki. Eredményeink bizonyítékot szolgáltatnak a KD potenciális alkalmazására az iszkémiás stroke megelőzésében.

Bevezetés

Az iszkémiás stroke-ot, a destruktív agyi érrendszeri megbetegedések egyik vezető okát a zavart véráramlás és az agysejtek glükóz-/oxigénhiánya jellemzi, ami sejtdiszfunkciót eredményezhet (Fisher és Saver, 2015). Az ischaemiás stroke jelenlegi kezelése komplex molekuláris mechanizmusai miatt korlátozott (Barrett et al., 2015). A gyulladás fontos szerepet játszik az ischaemiás stroke patogenezisében, és a jelenlegi vizsgálatokban a nukleotid-kötő domén (NOD) -szerű receptor protein 3 (NLRP3) gyulladásos szerepe volt a stroke-ban (Kawabori és Yenari, 2015). Az NLRP3 gyulladásmolekula egy olyan molekuláris platform, amelyben a gyulladás kiváltására aktiválódnak a gyulladásgátló citokinek (például kaszpáz-1 és interleukin-1β [IL-1β]) (Ogura et al., 2006). Megerősítették, hogy az NLRP3 gyulladásos betegség az ischaemiás stroke kialakulása óta aktiválódik (Fann és mtsai, 2013b), és az NLRP3 gyulladásos betegeket célzó kezelések ígéretesnek bizonyultak a stroke kezelésében (Yang és mtsai, 2014).

Fiziológiai körülmények között az NLRP3 általában az endoplazmatikus retikulumban (ER) lokalizálódik. Aktiválás után az NLRP3 és annak adapterrel apoptózishoz kapcsolódó Speck-szerű fehérje (ASC) transzlokálódik a perinukleáris térbe, ahol együtt lokalizálódnak az ER és a mitokondriális organelle-klaszterekkel (Jo és mtsai, 2016). A mitokondriumok rendkívül dinamikus organellák, amelyek képesek közlekedni, osztódni és összeolvadni. A mitokondriális hasadás és a fúzió ciklusai biztosítják a normális metabolikus és bioenergetikus funkciókat (Bertholet et al., 2016). A mitokondriális hasadás kiválthatja az NLRP3 gyulladást az RNS vírusfertőzés során, amelyben a dinaminnal összefüggő protein1 (Drp1), a mitokondriális hasadás kulcsszabályozója játszik fontos szerepet (Rayamajhi és Miao, 2014). Korábbi tanulmányunk kimutatta, hogy a mitokondriumba transzlokálódó Drp1 közvetítette a mitokondriális hasadást, a Drp1 transzlokáció farmakológiai gátlása pedig megakadályozta a mitokondriális töredezettséget, ezért megvédte az idegsejteket az oxigén – glükóz nélkülözés (OGD) által kiváltott sérüléstől (Zhao et al., 2013). Az a mechanizmus azonban, amely által a Drp1 szabályozza az iszkémiás stroke-ban az NLRP3 által közvetített gyulladást, továbbra sem tisztázott.

Az iszkémiát követően az újonnan szintetizált fehérjék felhalmozódnak, hogy növeljék a kibontakozott fehérje választ (UPR). A súlyos és tartós UPR ER stresszt okozhat. Az IRE1a ER stresszérzékelő tioredoxinnal kölcsönhatásba lépő fehérjét (TXNIP) indukálhat az NLRP3 által közvetített gyulladás és a programozott sejtpusztulás aktiválására (Lerner et al., 2012). A mitokondriális hasadásból keletkező reaktív oxigénfajok (ROS) aktiválhatják az NLRP3 gyulladásos rendszert, hogy súlyosbítsák az ER stresszt, ami tovább rontja a mitokondriális morfológiát és funkciót (Minutoli et al., 2016). Az ER stressz szupressziójáról és/vagy ROS generációjáról is megállapították, hogy enyhíti az NLRP3 által közvetített gyulladást a stroke-ban.

A véráramlás megzavarása és/vagy a vércukor-koncentráció csökkenése iszkémiás stroke-ban agykárosodást okozhat. A keton testek (KB), amelyek magukban foglalják az acetoacetátot és a β-hidroxi-butirátot (BHB), alternatív szubsztrátként szolgálhatnak az agy glükózjánál. A BHB a KB-k egyik fő tagja. Zsírsav oxidációval keletkezik, és a máj mitokondriumában ketogenezissel átalakulhat BHB-vé. Úgy találták, hogy a ketogén étrend (KD) vagy a BHB javítja az agy ödémáját és az infarktus térfogatát a stroke után (Suzuki és mtsai, 2001). Sőt, a BHB megakadályozhatja a glükózmegvonás vagy a hipoxia okozta idegsejtek halálát (Camberos-Luna és mtsai, 2016). A legújabb vizsgálatok azt is feltárják, hogy a BHB képes elnyomni az NLRP3 gyulladásos aktivációját humán hepatoma HepG2 sejtekben és monocitákban (Youm és mtsai, 2015; Bae és mtsai, 2016). Ugyanakkor a KB-k szerepe az iszkémia után az NLRP3 gyulladásos szabályozásában a központi idegrendszerben továbbra sem ismert.

Ebben a tanulmányban a KD és a BHB hatását vizsgálták az NLRP3 gyulladásos egereken, közepes agyi artéria elzáródással (MCAO), illetve OGD/reoxigenizációnak (OGD/R) alávetett SH-SY-5Y sejtekkel, és a potenciális mechanizmus tovább folytatódott feltárt. Eredményeinkből kiderült, hogy a KD és a BHB képes volt javítani az agyi ischaemiát az NLRP3 gyulladásos aktivációjának gátlásával, amelyet a Drp1-közvetített mitokondriális hasadás és az ER stressz gátlásának tulajdonítottak.

Anyagok és metódusok

Állatok és étrendi protokollok

A hím C57BL/6 egereket (4 hetes korban) a Fudani Egyetem Kísérleti Állatközpontjában helyezték el 26 ° C-on, 12 óra/12 óra világos/sötét ciklusokkal, és ad libitum élelmiszerhez és vízhez való hozzáférés. Az egereket véletlenszerűen négy csoportba soroltuk: kontroll csoportba (az egereket standard chow-val etettük [Teklab, 8664]); KD csoport (az egereket magas zsírtartalmú és alacsony szénhidráttartalmú étrenddel etették [ResearchDiets, D12369B]); magas szénhidráttartalmú (HC) étrendcsoport (az egereket alacsony zsírtartalmú, HC-diétával etették [ResearchDiets, D12359]); CP-456773 csoport (egerek egyetlen dózist kaptak orális CP-456773-ból [50 mg/kg, NLRP3 gyulladásgátló, Sigma PZ0280] 3 hétig standard chow-val). Az egereket kijelölt étrendekkel etettük (három étrend összetételét az 1. táblázat mutatja) 3 hétig. A randomizálás előtt az egyes csoportok egereit 18 órán át éheztettük a vércukorszint stabilizálása és a ketózis állapotának elindítása érdekében. Valamennyi eljárást a Kínai Népköztársaság Nemzeti Tudományos Tanácsának útmutatója szerint hajtották végre. A tanulmányt a kínai Sanghaji Fudan Egyetem Etikai Bizottsága hagyta jóvá. Az IRB jóváhagyási száma: „20150572A259”. Ez a kézirat az Animal Research: Reporting (Állatkutatás: Jelentés) szerint készült in vivo Kísérletek (ARRIVE) iránymutatás.

Asztal 1. A tanulmányban alkalmazott egér-diéták makrotápanyag-összetétele.

Az MCAO modell létrehozása

Az egereket ketamin 65 mg/kg és xilazin 6 mg/kg intraperitoneális injekcióval altattuk. Egy bevont filamentumot illesztettek a jobb középső agyi artériába (MCA) 45 perc elzáródáshoz, majd reperfúziót. A testhőmérsékletet 37 ° C-on tartottuk fűtőbetét és visszacsatoló vezérlő rendszer (Bowdoin, ME, USA) használatával. Lézeres Doppler szondát helyeztek a koponyára (5 mm oldalirányban és 2 mm hátul a bregmától), hogy ellenőrizzék az agyi véráramlást (CBF). 3 sejt/üreg egerek). Röviden, 20 μl MTT-oldatot (5 mg/ml) adtunk az egyes mélyedésekhez 0,5 mg/ml végkoncentrációban, majd 4 órán át inkubáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, és minden egyes üregbe 150 μl dimetil-szulfoxid-oldatot adtunk, majd 20 percig inkubáltuk. Az abszorbanciát 570 nm-en, referencia hullámhosszon 630 nm-nél mértük. A kísérlet három példányban történt.

ATP mérése

Az ATP keletkezését nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) detektáltuk, amint arról korábban beszámoltunk (Cui és mtsai., 2010). Röviden, a táptalajt eltávolítottuk a sejtekből, és azonnal hozzáadtunk folyékony nitrogént. Jeges bepárlás után 300 µl jéghideg 0,4 mólos perklórsavat adunk mindegyik üreghez. A sejteket összegyűjtöttük, és 14 000-nél centrifugáltuk g 15 percig 4 ° C-on. A felülúszót 1 M K2CO3-tal semlegesítettük, -80 ° C-on tartottuk a perklorát kicsapása céljából, majd centrifugáltuk. A felülúszót HPLC-re gyűjtjük. Egy 12 csatornás CoulArray 5600A-t (ESA Inc.) és egy reverz fázisú oszlopot (Lichrospher-100, Merck) használtunk. A jeleket UV detektorral (# 526, ESA Inc.) detektáltuk 260 nm-en, és a CoulArray analóg bemeneti adapterrel átalakítottuk a CoulArray® szoftverrel végzett elemzés előtt. Minden csúcsterület a standard görbék lineáris tartományán belül volt.

A mitokondriális membránpotenciál mérése

A mitokondriális membránpotenciált (MMP; Δψm) konfokális mikroszkóppal határoztuk meg a tetrametil-rodamin-etil-észter (TMRE) festést követően, a korábban leírtak szerint (Zhao et al., 2013). A kezelés után az SH-SY-5Y sejteket TMRE-vel (végkoncentráció: 50 nM) inkubáltuk 20 percig 37 ° C-on. A fluoreszcenciát a BD FACS Canto ™ II áramlási citometriás rendszerrel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) detektáltuk. A nem sejttörmelékeket és az elhalt sejteket kikapcsoltuk, és

30 000 eseményt gyűjtöttek elemzés céljából. A sejteket 20 μM karbonil-cianid-4- (trifluor-metoxi) -fenil-hidrazonnal (FCCP) kezeltük 20 percig, hogy Δψm összeomoljon, és a kapott TMRM-fluoreszcenciát használtuk a küszöbérték meghatározásához. Az adatokat a sejtek százalékában fejezzük ki, amelyeknél a jel meghaladja a küszöbértéket.

ROS Assay

Az SH-SY-5Y sejteket 80% -os összefolyásnál a fentiek szerint kezeltük. A sejteket ezután PBS-sel mostuk és ROS Fluorescent Probe-DHE-vel (Vigorous Biotechnology, Peking, Kína) inkubáltuk 30 percig 37 ° C-on. Háromszor hideg PBS-sel végzett mosás után a fluoreszcenciát mikrotányér-leolvasóval mértük 485 nm gerjesztési hullámhosszon és 525 nm emissziós hullámhosszon.

A mitokondriális morfológia értékelése

Az SH-SY-5Y sejteket poli-D-lizinnel bevont fedőlemezeken tenyésztettük. A mitokondriumokat DsRed-Mito (1 μg/60 mm-es edény, Clontech, USA) címkével láttuk el a gyártó utasításai szerint. A sejteket ezután 4% paraformaldehiddel rögzítettük, és a fedőlemezeket Prolong Gold Antifade Reagens és DAPI (Invitrogen) alkalmazásával szereltük fel. A képeket fordított epifluoreszcens mikroszkóppal rögzítettük (Olympus, Tokió, Japán). A túlnyomórészt ép tubuláris mitokondrium hálózattal rendelkező sejteket normálisnak találták. A megszakadt és túlnyomórészt gömb alakú mitokondriumokat tartalmazó sejteket a mitokondriális hasadással rendelkező sejtekként azonosították. A mitokondriumok méretét és alakját vak módon számszerűsítettük ImageJ (NIH kép) alkalmazásával.

Drp1 Translocation

SH-SY-5Y sejteket használtunk a Drp1 transzlokáció vizsgálatához. A sejteket poli-D-lizinnel bevont fedőlemezeken tenyésztettük, és 1 μg DsRed-Mito-val és 1 μg Drp1-myc-vel transzfektáltuk. Az OGD után a sejteket fixáltuk és immunfestést végeztünk anti-myc antitesttel, majd AlexaFluor 488 szekunder antitesttel (Invitrogen). A képeket konfokális mikroszkóppal rögzítettük és elemeztük. Körülbelül 60 sejtet elemeztek csoportonként négy független kísérletben.

Mitokondriális izoláció

A mitokondriumokat a mitokondriális izolációs készlet (Pierce, Rockford, IL, USA) segítségével izoláltuk a gyártó utasításainak megfelelően. Röviden: az SH-SY-5Y sejteket a Dounce homogenizátorban homogenizáltuk, majd 750 ° C-on centrifugáltuk. g 10 percig 4 ° C-on. A felülúszót tovább centrifugáltuk 12 000-nél g 15 percig 4 ° C-on, majd az üledéket mostuk és mitokondriális frakcióként visszatartottuk.

Enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) assay

Az agyszöveteket (az MCA által szállított agyi régiókat) a kezelés után összegyűjtöttük és 1x PBS-sel öblítettük. A kaszpáz-1 aktivitás vizsgálatához az agyszöveteket lízispufferben (BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA) homogenizáltuk, majd 10 000-nél centrifugáltuk g 10 percig, majd a felülúszót összegyűjtjük. Mert in vitro kísérletekben körülbelül 5x106 sejtet gyűjtöttünk össze, szuszpendáltunk 50 μl előhideg lízispufferben, 10 percig jégen inkubáltuk, majd 10 000-nél centrifugáltuk g 1 percig, és a felülúszót összegyűjtjük. A felülúszó fehérjekoncentrációját Bradford-vizsgálattal határoztuk meg. A kaszpáz-1 aktivitás kimutatásához Caspase-1 fluorometriai vizsgálati készletet (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA) használtak a gyártók utasításai szerint. Meghatároztuk a fluoreszcencia (kaszpáz-1 aktivitás) többszörös változását, mint a kontroll csoportban.

Az IL-1β méréséhez az agyszöveteket (az MCA által szállított agyi régiókat) 20 ml 1x PBS-ben homogenizáltuk, és a lizátumot összegyűjtöttük. Ezen kívül a sejttenyészet táptalaját is összegyűjtötték a méréshez. A mintákat 5000 ° C-on centrifugáltuk g 5 percig, és a felülúszót összegyűjtjük. Az IL-1β koncentrációt a RayBio ® Human IL-1 β enzimmel kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készlet (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, USA) segítségével mértük a gyártó utasításainak megfelelően. Az abszorbanciát 450 nm-nél közvetlenül a stopoldat hozzáadása után mértük.

Western Blotting

Statisztikai analízis

Az adatokat átlagként ± az átlag standard hibájaként (SEM) fejezzük ki. Az összehasonlításokat egy- vagy kétirányú ANOVA-val végezték, amelyet Newman-Keuls követett post hoc páronkénti összehasonlítások tesztelése. A statisztikai elemzést az SPSS 22. verziójával (IBM, Armonk, NY, USA) végeztük. Értéke # # # 2/4π terület. A képarány a fő/mellék tengelyek mérése. Mindkét érték megközelíti az 1-et, amikor a részecske körkörösebbé válik. Három független kísérletben 10-15 véletlenszerűen kiválasztott sejt kvantifikálását végeztük. Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be; * # # # # # # Kulcsszavak: ketogén diéta, β-hidroxi-butirát, mitokondriális hasadás, endoplazmatikus retikulum stressz, NLRP3 gyulladás, Drp1

Idézet: Guo M, Wang X, Zhao Y, Yang Q, Ding H, Dong Q, Chen X és Cui M (2018) A ketogén diéta javítja az agyi iszkémiás toleranciát és gátolja az NLRP3 gyulladásos aktiválódását a Drp1-közvetített mitokondriális hasadás és az endoplazmatikus retikuláris stressz megelőzésével. . Elülső. Mol. Neurosci. 11:86. doi: 10.3389/fnmol.2018.00086

Beérkezett: 2017. november 29 .; Elfogadva: 2018. március 05 .;
Publikálva: 2018. március 20.

Andrei Surguchov, a Kansasi Egyetem Orvosi Központja, Egyesült Államok

Mustapha Umar Imam, Zhengzhou Egyetem, Kína
David Ruskin, Trinity College, Egyesült Államok

† Ezek a szerzők egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.