A Helicobacter pylori fertőzés duodenitist és felszíni duodenum fekélyt indukál mongol

Jelentkezzen be felhasználónevével és jelszavával

Főmenü

Jelentkezzen be felhasználónevével és jelszavával

Ön itt van

itthon
Archívum
52. évfolyam, 6. szám
A Helicobacter pylori fertőzés duodenitist és felszíni duodenum fekélyt vált ki a mongol futóegéren

Cikk
Szöveg
Cikk
info
Idézet
Eszközök
Ossza meg
Válaszok
Cikk
metrikák
Figyelmeztetések

T Ohkusa 1,
Én Okayasu 2,
H Miwa 1,
K Ohtaka 1,
S Vége 3,
N Sato 1

1 Gasztroenterológiai Tanszék, Juntendo Egyetem Orvostudományi Kar, Tokió, Japán
2 Patológiai Tanszék, Kitasato Egyetem Orvostudományi Kar, Sagamihara, Japán
3 Állatkutató Központ, Tokiói Orvosi és Fogorvosi Egyetem, Tokió, Japán

Levelezés:
Dr. N Sato, a Juntendo Egyetem Orvostudományi Karának Gasztroenterológiai Tanszéke, 2-1-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokió 113-8421, Japán;
nsatomed.juntendo.ac.jp

Absztrakt

Háttér: Nincs közvetlen bizonyíték a Helicobacter pylori által kiváltott nyombélfekély állatmodelljére.

Cél: Ebben a tanulmányban értékeltük a baktériumtörzs és a kísérleti állatok életkorának szerepét a duodenitis és a nyombélfekély indukciójában mongol futóegéren H pylori fertőzés után.

Mód: A specifikus kórokozótól mentes mongol futóegéreket orálisan oltottuk be három baktériumtörzzsel (H pylori ATCC 43504, TN2GF4 és K-6, klinikánk gyomorrákos páciensének klinikai izolátuma). Ezek a törzsek tartalmazzák a cagA gént és a VacA-t is. Öt hetes futóegéreket alkalmaztunk a koraszülött fertőzés utánzásához, és 14 hetes állatokat használtunk érett tesztalanyként. Az állatokat az oltás után 12 hétig figyeltük meg. Az interleukin 8 (IL-8) termelést a gyomor hámsejtjeiben (MKN74) a H pylori törzsekkel végzett tenyésztés után ELISA-val mértük.

Eredmények: A három törzzsel fertőzött összes futóegérben gyomorhurutot és gyomorfekélyt találtak. A duodenitist és a gyomormetapláziát azonban gyakrabban észlelték TN2GF4 és K-6 törzsekkel fertőzött futóegéreken, mint az ATCC 43504 fertőzött vagy kontroll csoportokban (p

Statisztikák az Altmetric.com-tól

nyombélfekély
Mongol futóegér
Helicobacter pylori
duodenitis
nyombélfekély

VacA, vakuolizáló citotoxin A
CFU, kolóniaképző egységek
PAS, periodikus sav-Schiff
ELISA, enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálat
OD, optikai sűrűség
IL-8, interleukin 8
FBS, szarvasmarha magzati szérum

A Helicobacter pylori fertőzés emberben a nyombélfekélyt, a legtöbb gyomorfekélyt, 1 és a 2 adenokarcinómát okozza. A H pylori fertőzés kísérleti modelljeit gnotobiotikus malacok, 3 eutimikus csíra mentes egér, 4 athmikus meztelen egér, 5 és majmok felhasználásával írták le. A mongol futóegér a H pylori fertőzés megfelelő állatmodelljének is tűnik. 7–9 Az emberi H pylori fertőzést utánzó gyomor-bélrendszeri betegségek, például gyomorhurut, gyomorfekély és adenokarcinoma tanulmányozhatók a mongol futóegér modellben. Nincs azonban közvetlen bizonyíték arra, hogy a H pylori fertőzés valójában nyombélfekélyt indukálna ebben az állatmodellben. Az olyan változók hatásait, mint a H pylori fertőzés törzskülönbségei és a kísérleti állat kora, nem vizsgálták.

Ebben a tanulmányban mind az éretlen, mind az érett mongol futóegéreket megfertőztük három H pylori törzzsel. Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk mind a baktériumtörzs, mind az alany korának szerepét a nyombélfekély evolúciójában a H pylori fertőzés után.

MÓD

Baktériumtörzsek

Az ebben a vizsgálatban alkalmazott baktériumtörzsek a következők voltak: H pylori ATCC 43504 (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA), TN2GF4 (a Takeda Chemical Industries, Ltd. ajándéka, Osaka, Japán) és a K-6, amelyet gyomorrákos beteg klinikánkon. Ezek a törzsek tartalmazzák mind a cagA gént, mind a vakuolizáló citotoxin A-t (VacA), amelyet a polimeráz láncreakció 10. módszerével és a citotoxin vizsgálattal igazoltak. 11 A baktériumokat mikroaerofil körülmények között, 37 ° C-on tenyésztettük négy napig véragaron. Az ezt követő tenyésztés 24 órán át Brucella húslevesben (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) volt 10% lószérummal.

Állatok

Specifikus kórokozótól mentes hím mongol futóegéreket (amelyeket a Tokiói Orvosi és Fogorvosi Egyetem Állatkutató Központjában tenyésztettek) öt és 14 hetes korukban fertőztek meg. A specifikus kórokozótól mentes azt jelenti, hogy a futóegér nem fertőzött és mentes a Sendai vírustól, az egér hepatitis vírusától, a Mycoplasma pulmonis, a Clostridium piliforme, a Dermatophytes, a Citrobacter rodentium, a Pasteurella pneumotropica, a Corynebacterium kutscheri, a Pseudomonas aerginosa, a Salmonella spp, a Staphylococcus Staphylococcus muris, Spironucleus muris, Syphacia spp, Helicobacter spp és Aspicularis tetrapttera. Ketrecenként három-öt állatot helyeztek el, és szabad hozzáférést kaptak mind a kereskedelmi rágcsáló-étrendhez (CE-2; Clea Japan, Tokió, Japán), mind a steril vízhez. A 24 órán át éhező állatoknak etetőtűn keresztül egyetlen intragasztrikus dózist kaptak, 1 ml 1x108 telepképző egység (CFU)/ml H pylori szuszpenziót. A kontroll állatok egyedül Brucella húslevest kaptak.

Szövettan és kultúra

Mind a kísérletileg fertőzött, mind a kontroll gerelyeket 12 héttel az oltás után altatásban méhnyak diszlokációval feláldoztuk. A gyomrokat a nagyobb görbület mentén nyitották meg, kezdve a gyomor-nyelőcső csatlakozásánál és a duodenum proximális részén végződve, és az esetleges gasztroduodenális elváltozásokat makroszkóposan figyelték meg. A mintadarab felét papírra tűztük és 10% semleges pufferelt formalinban rögzítettük szövettani vizsgálatra rutin módszerekkel. A rögzített szövetet hosszanti csíkokra vágtuk a gastroduodenalis nyálkahártya vizsgálatához. A paraffinba ágyazott szakaszokat levágtuk és festettük haematoxilin-eozinnal, Giemsa-val és periodikus sav-Schiff-szel (PAS).

A minta fennmaradó felét Brucella húslevessel homogenizáltuk, hígítottuk és beoltottuk egy módosított Skirrow-agarra. A tenyészeteket 37 ° C-on inkubáltuk hét napig mikroaerob körülmények között. A fertőzést a telepek lemezenként történő számlálásával számszerűsítettük, és log CFU-ként fejeztük ki a gastroduodenalis falon.

A pylorus típusú nyálkahártya vastagságát a véletlenszerűen kiválasztott foveoláris epithelium zóna öt pontján mértük a középső antrumban, haematoxilin-eozinnal festett tárgylemezeken, amelyeket az egyes futóegér gyomrából kaptunk. Mivel a nyálkahártya gyulladásos összetevője gyakorlatilag megegyezett az emberi H pylori gastritisben tapasztalhatóval, az aktivitás, a gyulladás, az atrófia és a bélmetaplázia mértékét a frissített Sydney-rendszer szerint osztályozták. 12 A H pylori jelenlétét hisztológiailag diagnosztizálták a Giemsa-val festett mintákban. A proximális duodenumot a pylorus gyűrű és a Brunner-mirigy azonosításával igazolták. A gyomormetapláziát úgy definiáltuk, mint az apikális PAS-pozitív semleges mucin tartalmú gyomorhámsejtek gócainak előfordulását, az ecsethatár hiányával. Az összes kóros elemzést vakon végezte el egy patológus (IO).

Szerológia

Vérmintákat érzéstelenített állatokból szívszúrással nyertünk az áldozat idején. A H pylori elleni szérum IgG antitestet enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA; HM-CAP, EPI, New York, USA) mértük. A Seac Yoshitomi Ltd-nél (Fukuoka, Japán) kifejlesztett ELISA rendszert alkalmaztuk a mongol futóegér anti-H pylori IgG mennyiségének meghatározására, peroxidázzal konjugált antimouse immunglobulinokat (Dako Japan, Tokió, Japán) használva másodlagos antitestként. Az optikai sűrűséget (OD) 450 spektrofotometriásan mértük (Emax; Japan Molecular Device Co., Hyogo, Japán). A 0,1 OD határértéke a H pylori fertőzés szerológiai bizonyítékát jelezte (Ikeda, személyes kommunikáció).

Interleukin 8 (IL-8) szekréció stimulálása a gyomor hámsejtvonalában

A H pylori törzseket 10% lóvért tartalmazó módosított Skirrow agarban gyűjtöttük hét napon keresztül, 37 ° C-on, mikroaerob körülmények között. A kolóniák eldobható műanyag hurokkal történő összegyűjtése után 1 × 107 sejt/ml koncentrációban szuszpendáltuk őket 10% magzati szarvasmarha-szérumot (FBS) (Sigma) tartalmazó RPMI 1640-ben (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, USA) és azonnal felhasználják.

Az MKN74 humán gyomor hámsejtvonalat (JCRB0255; Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japán) 10% FBS-sel kiegészített RPMI 1640-ben tartottuk fenn. Az IL-8 mennyiségi meghatározásához 24 lyukú lemezeken lévő MKN74 sejt egyrétegű anyagokat tenyésztettünk H pylori törzsekkel vagy anélkül öt órán át, három ismétlésben. Ezután a felülúszókat eltávolítottuk a mélyedésekből, 15 000 g-vel centrifugáltuk, és -70 ° C-on tároltuk, amíg az ELISA (R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA) IL-8 fehérjére vizsgálta a gyártó protokollja szerint. Minden eljárást két példányban végeztek.

statisztikai elemzések

Az ATCC-43504, TN2GF4 és K-6 baktériumtörzsek Helicobacter pylori fertőzésének jellemzői mongol futóegéren

Makroszkópos és hisztopatológiai eredmények

Az összes fertőzött futóegér antrális nyálkahártyáját kitágítottuk és bőséges nyálkával megvastagítottuk (1A. Ábra). Gyomorfekély elváltozásokat észleltünk az antrumban (pylorus típusú nyálkahártya) minden fertőzött futóegéren (1A. Ábra). A TN2GF4 és a K-6 csoportban a legtöbb fertőzött futóegér nyombél nyálkahártyája megvastagodott és eróziós elváltozásokat mutatott (1B. Ábra). A kontroll állatok gyomor- és nyombél nyálkahártyája normális volt (1C. Ábra).

(A) A fertőzött futóegér antrumában, 12 héttel a Helicobacter pylori TN2GF4 baktérium törzs beoltása után, kitágult és megvastagodott nyálkahártya volt, bőséges nyálkával. A gyomorfekély elváltozásai láthatók az antrumnál (pylorus típusú nyálkahártya, nyíl). (B) A TN2GF4 csoportba tartozó fertőzött futóegér nyombélében megvastagodott nyálkahártya és két felszíni fekély (nyilak) volt. (C) A kontroll csoportba tartozó nem fertőzött futóegér gyomor- és nyombélnyálkahártyája nem mutatott látható változásokat.

A gyomor szakaszainak hisztopatológiai eredményeit a 2. és a 3. táblázatban mutatjuk be. A 14 hetes korban (p = 0,008 és 0,009) és a pylorus régióban mindkét korcsoportban (14 hét: p = 0,016 és 0,011; öt hét: p = 0,003 és 0,007). Az öthetes korban fertőzött futóegérek fundus régiójában a neutrofil aktivitás és a krónikus gyulladás enyhébb volt, és ritkábban figyelték meg őket, mint a 14. héten fertőzött állatoknál. A TN2GF4 törzzsel 14 hetes korban megfertőzött futóegerek fundusos régiójában a neutrofil aktivitás és a krónikus gyulladás magasabb volt, mint az öt hetes ATCC törzsé, és a legmagasabb a fertőzött futóegér között. A fertőzött állatok pylorus régiójában a nyálkahártya vastagsága mindkét korcsoportban szignifikánsan nőtt a kontrollokkal összehasonlítva (p = 0,008, 0,007), és a TN2GF4 törzsű, 14 hetes fertőzött futóegér vastagsága nagyobb volt, mint a K-6 törzs vastagsága öt hetes korban, és a legmagasabb a fertőzött futóegérek között.

A Helicobacter pylori ATCC-43504, TN2GF4 és K-6 törzsekkel fertőzött mongol futóegér gyomrában és nyombélében szövettani elváltozások

A Helicobacter pylori ATCC-43504, TN2GF4 és K-6 törzsekkel fertőzött mongol futóegér gyomrában és nyombélében szövettani eredmények

A nyálkahártya propriájára korlátozódó vagy az izomrétegig terjedő gyomorfekélyeket az összes fertőzött futóegér pylorus típusú nyálkahártyájának régiójában, de a fundus típusú nyálkahártyán nem észlelték (2. táblázat). A 26 fertőzött állatból 17-ben (65%) gyomorfekélyt találtak a pylorus típusú nyálkahártyában felületes fekélyként (erózió). Mirigy atrófiát, bélmetapláziát, hiperplasztikus polipot vagy adenokarcinómát nem figyeltek meg fertőzött futóegéren.

(A) A sűrű neutrofil és mononukleáris sejtek beszivárgásával jellemezhető duodenitisz egy Helicobacter pylori K-6 baktérium törzzsel fertőzött futóegéren (haematoxilin-eozin, eredeti nagyítás × 100). (B) A nyombél nyálkahártyája a H pylori TN2GF4 baktériumtörzssel fertőzött futóegérben a 14. héten periodikus sav-Schiff festéssel pozitív volt, jelezve a gyomor metapláziáját (eredeti nagyítás × 200). (C) A TN2GF4 csoportba tartozó, fertőzött futóegérben a duodenumban a gyomor metaplázia nyálkahártyáját a 14. héten beoltva H pylori (nyilak) gyarmatosította (Giemsa, eredeti nagyítás × 400). (D) A felületes duodenális fekély (nyilak) a gyomor metapláziájában súlyos duodenitisben nyilvánvaló volt a TN2GF4 csoportba tartozó gerincen, amelyet 14. héten oltottunk be. Brunner mirigyei a gyomor metapláziája alatt láthatók (haematoxilin-eozin, eredeti nagyítás × 100). (E) Nem kontrollált duodenitis a kontroll csoport nem fertőzött futóegérén (haematoxilin-eozin, eredeti nagyítás × 200).

Az IL-8 szekréció stimulálása a gyomor hámsejtvonalában

Összehasonlítva az MKN74 sejtekben az IL-8 termelést a H pylori törzsekkel való együtt tenyésztés után, a TN2GF4 törzs szignifikánsan magasabb IL-8 szintet stimulált (1538 (303) pg/ml) (3. ábra), mint az ATCC 43504 törzs (154 (24) pg/ml; p = 0,0039) és K6 (175 (6) pg/ml; p = 0,0039). Az ATCC 43504 és a K6 törzsek IL-8-termelése szignifikánsan magasabb volt, mint a kontrolloké (55 (8) pg/ml; p = 0,0038 és 0,0039).

Interleukin 8 (IL-8) termelés MKN74 sejtekben a Helicobacter pylori három baktérium törzsével végzett együtt tenyésztés után. ** p 7–9, 13–17, de a nyombélfekély előfordulása nem következetes jellemzője a fertőzésnek. Az ATCC 43504 törzs fertőzését követően 12 és 24 héttel a duodenumban enyhe vagy közepesen súlyos gyulladásról számoltak be, de fekélyes elváltozásokat nem találtak, és a gyomor metaplázia előfordulását nem írták le. 13, 14 Ebben a tanulmányban beszámoltunk a nyombélfekély előfordulásáról a H pylori fertőzött 14 hetes mongol futóegérben. A nyombélfekélyt csak hat állatból kettőnél (33%) találtuk meg TN2GF4-sel fertőzött 14. héten, és az ATCC 43504 vagy a K-6 csoport egyikében sem. Sőt, öt hetes korban fertőzött állatokban nem találtak fekélyt, a törzstől függetlenül. Ezek az eredmények megmagyarázhatják, miért nem figyelték meg a nyombélfekélyt a korábbi 13, 14 vizsgálatokban, amelyek az ATCC 43504 törzset használták a gerelyek H pylori fertőzésére 4-5 hetes korban. Ismeretlen okokból az ebben a korcsoportban élő állatok és az ATCC 43504 törzs nem tűnik megfelelőnek a nyombélfekély kiváltására.

Mirigy atrófiát és bélmetapláziát találtak a mongol futóegéren, 26 héttel a H pylori oltás után. Vizsgálatunk során azonban az oltás után 12 hétig figyeltük meg a fertőzött állatokat, és sem atrófiát, sem bélmetapláziát nem találtunk a gyomorban. Hansson és mtsai arról számoltak be, hogy a nyombélfekély betegség védőhatással bír a gyomorrák kialakulása ellen. 24 Mivel a jelen vizsgálatban szereplő összes nyombélfekély egyidejűleg jelentkezett gyomorfekélyekkel, ez a modell nem használható e védőhatás igazolására.

Néhány gyomorfekélyes betegnek van vagy volt nyombélfekélye, és az egyidejűleg előforduló gyomor- és nyombélfekély előfordulása 7-64% között mozog. A közelmúltban egy esettanulmány arról számolt be, hogy a H pylori fertőzés a legszorosabb összefüggést mutatta a gastroduodenalis fekélyrel, összehasonlítva a gyomorfekélyrel a gyomortestben és a prepylorikus régióban. 26 A legtöbb esetben úgy gondolták, hogy a nyombélfekély az elsődleges betegség, a gyomorfekély másodlagosan fordul elő, de egy tanulmány azt mutatta, hogy egyes betegeknél a gyomorfekély volt az elsődleges betegség. 27 Jelen vizsgálatunkban a gyomorfekélyt találtuk elsődleges betegségnek a H pylori-hoz társuló gastritis miatt, és a nyombélfekély ritkán, viszonylag korai szakaszban, 12 héttel a H pylori fertőzés után következett be. Ez lehet az oka annak, hogy a nyombélfekélyek felszínesek voltak és nem gyakoriak a modellünkben. Nord és mtsai arról számoltak be, hogy a három évesnél fiatalabb gyermeknél gyomor antrális fekélyt találtak, de nem gyomortestet vagy nyombélfekélyt. 28 Azt is kimutatták, hogy a nyombélfekélyt először egy ötéves gyermeknél észlelték, és az életkor növekedésével gyakoribbá vált. Ez hasonlíthat az eredményeinkre, ahol két nyombélfekélyt találtak két gerincen, amelyeket 14. héten oltottak be TN2GF4 törzzsel, de öt héten belül egyiket sem.

Ismeretes, hogy a H pylori fertőzés leginkább gyermekkorban fordul elő, és a felnőtteknél új fertőzés ritka. A H pylori epidemiológiai vizsgálata mind szerológiai, mind karbamid-leheletvizsgálattal kimutatta, hogy a fertőzést általában 30–32 éves gyermekkorban szerezték meg, és felnőttkorban a megszerzés aránya nagyon alacsony. 33, 34 Ebben a vizsgálatban a H pylori fertőzési aránya magas volt (100%), és hasonló volt éretlen és érett futóegéren egyaránt. E tekintetben a mongol gerbil modell nem hasonlítható össze az emberi H pylori fertőzéssel.

Összefoglalva: az emberi H pylori fertőzést utánzó gyomorhurut, gyomorfekély és adenokarcinoma H pylori beoltással indukálódott a mongol futóegérben. Ezenkívül mind a duodenitis, mind a duodenum fekélyt kor és törzsfüggő módon indukálta a H pylori fertőzés. Ez megfelel Koch posztulátumainak azon követelményeinek, amelyek szerint a H pylori szerepet játszik a nyombélfekély kórokozójaként, és érvényesíti a betegség vizsgálatának modellrendszerét. A nyombélfekély előfordulási aránya azonban nem volt szignifikáns a kontrollok szempontjából; jelentőségének meghatározásához nagyobb számú állatra van szükség.