A testmozgás visszafordítja a magas zsírtartalmú étrend által okozott károsodásokat a rekeszek felosztása és aktiválása során
Absztrakt
Kísérleti terv.
Az összes kísérleti eljárást a Kaliforniai Állami Egyetem Northridge Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá, és megfelelt a laboratóriumi állatok felhasználására vonatkozó, az Egyesült Államok Egészségügyi és Emberi Erőforrások Minisztériuma által kiadott irányelveknek.
Hátsó szárú perfúziók.
Az állatokat pentobarbitál-nátrium (6,5 mg/testtömeg 100 g) intraperitoneális injekcióval érzéstelenítjük, és műtéti úton előkészítjük a hátsó végtag perfúziójára, Ruderman és munkatársai által korábban leírtak szerint. (47) és módosította Ivy és mtsai. (28) A műtéti előkészítést követően kanülöket illesztettek a hasi aortába és a vena cava-ba, és az állatokat pentobarbitál intrakardiális injekciójával leöltük, amikor a hátsó végtagokat 30 ml Krebs-Henseleit pufferrel (KHB; pH 7,55) mostuk. A kanüleket azonnal egy nem recirkuláló perfúziós rendszerrel helyezték el, és a hátsó végtagokat hagyták stabilizálódni egy 5 perces mosási periódus alatt. A perfuzátumot folyamatosan gázosítottuk 95% O2-5% CO2 elegyével és 37 ° C-ra melegítettük. A perfuzátum áramlási sebességét 7,5 ml/perc értékre állítottuk be a stabilizálás és az azt követő perfúzió során, amelynek során meghatároztuk a glükóz transzport sebességét.
A perfúziókat jelenlétében ( = 8/csoport) vagy hiány ( = 8/csoport) 500 μU/ml inzulin. Az alap perfuzátum tápközeg 30% mosott, lejárt emberi eritrocita (Ogden Medical Center, Ogden, UT), KHB, 4% dializált szarvasmarha szérum albumin (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) és 0,2 mM piruvát. A hátsó végtagokat 1 mM glükózt tartalmazó perfuzátummal mostuk ki 5 percig a glükóz transzport mérésének előkészítése céljából. A glükóztranszportot egy 8 perces periódus alatt mértük a nem metabolizált glükóz analóg 3 8 mM koncentrációjával-O-metil-glükóz (3-MG; 32 μCi 3- [3 H] MG/mM; PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) és 2 mM mannit (60 μCi [1-14 C] mannit/mM; PerkinElmer Life Sciences). Közvetlenül a szállítási periódus után az RG egyes részeit kivágtuk mindkét hátsó végtagból, hideg KHB-vel nedvesített gézre foltoztuk, fagyasztva lezártuk N2 folyadékban, és későbbi elemzés céljából -80 ° C-on tároltuk.
3-MG szállítás.
Az inzulinnal stimulált vázizom 3-MG transzportjának sebességét a korábban leírtak szerint számoltuk (39, 56, 57).
Izomhomogenizálás a Western-blotoláshoz.
Az RG-ből részeket kivágtunk, fagyasztva lemértük, és jéghideg homogenizációs pufferben (1:10 tömeg/térfogat) homogenizáltunk, amely 50,0 mM HEPES-t (pH 7,6), 150 mM NaCl, 20 mM Na-pirofoszfát, 20 mM β-glicerofoszfátot tartalmaz., 10 mM NaF, 2 mM ortovanadát, 2 mM EDTA, 1% IGEPAL, 10% glicerin, 2 mM fenilmetil-szulfonil-fluorid, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 μg/ml leupeptin és 10 μg/ml aprotinin. A homogenizátumot ezután egy mikrocentrifuga csőbe vittük és centrifugáltuk (19 600 g, 4 ° C) hűtött mikrocentrifugában (Micromax RF; International Equipment, Needham Heights, MA) 15 percig. A felülúszót összegyűjtöttük, lizátumnak jelöltük, és megvizsgáltuk a fehérjekoncentrációt a Bradford-módszerrel (5), amelyet Benchmark mikrolemez-olvasóval (Bio-Rad, Richmond, CA) alkalmaztunk.
A plazmamembrán frakcionálása.
A plazmamembrán-frakciókat a korábban leírtak szerint állítottuk elő (42). Ez az eljárás egy dúsított plazmamembrán-frakciót és egy citoszol-frakciót biztosít, amely nélkülözi a plazmamembránokat (46). Röviden, az RG egy részét 8 × (tömeg/térfogat) jéghideg pufferben homogenizáltuk, amely 20 mM HEPES-t (pH 7,4), 2 mM EGTA-t, 50 mM β-glicerofoszfátot, 1 mM ditiotreitolt, 1 mM Na3VO4-et, 10% -ot tartalmaz. glicerin, 3 mM benzamidin, 10 μM leupeptin, 5 μM pepstatin A és 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid. A homogenizátumot 100 000-nél centrifugáltuk g 30 percig 4 ° C-on, és a felülúszót citoszolos frakcióként összegyűjtjük. Az üledéket 4x (tömeg/térfogat) jéghideg homogenizációs pufferben keverjük, majd 1% Triton X-et adunk hozzá. Az újraszuszpendált pelletet ezután 15 000-nél centrifugáltuk g 10 percig 4 ° C-on. A plazma membránfrakciót képviselő felülúszót összegyűjtöttük.
Western blottolás.
Akt2 kináz aktivitás.
aPKCζ/λ aktivitás.
Ötszáz mikrogramm RG citoszolos vagy plazmamembránfehérjét adtunk 4 μg anti-aPKCζ/λ-hoz (sc-216; SCBT), és egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on. Száz mikroliter Pro-A gyöngyöket tartalmazó szuszpenziót egyesítettünk mindegyik mintával, és 4 órán át forogva inkubáltuk 1,5 órán át. Inkubálás után a mintákat centrifugáltuk (18 300 g, 4 ° C) 10 percig, és az immunkomplexet a PI 3-kináz aktivitásnál leírtakkal megegyező eljárással mossuk (49). A mosási protokoll után a mintákat centrifugáltuk (18 300 g, 4 ° C) 10 percig, és a felülúszót eldobjuk. Ezután a Pro-A gyöngyöket 75 μl kináz pufferben szuszpendáltuk. A kináz reakciót 5 μCi [γ-32 P] ATP (PerkinElmer Life Sciences), 40 μM ATP és 5 μl mielin bázikus fehérje (M8-184; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) kombinálásával indítottuk el. A mintákat periodikusan vortexeltük, miközben 12 percig 37 ° C-on inkubáltuk. A reakciókat Laemmli puffer (1: 1) hozzáadásával állítottuk le. Az elemzéshez 15 μl minta/Laemmli puffert SDS-PAGE-nak vetünk alá redukáló körülmények között, 20% Tris-tricin felbontó gélen. Elektroforézis után a géleket műanyag csomagolásba csomagoltuk, és 8 órán át foszforszitán tettük ki. A képeket a fent leírt módon rögzítettük és számszerűsítettük.
IRS-1 tirozin és szerin foszforilezése.
Hatvan mikroliter Pro-A szuszpenziót, amelyet anti-IRS-1 antitesttel (kat. Sz. 06-248; UBT) vonunk be, 500 μg RG-lizátum fehérjéhez adunk, és 2 órán át 4 ° C-on inkubáljuk. . Inkubálás után a mintákat centrifugáltuk (18 300 g, 4 ° C) 10 percig, és az immunkomplexet mossuk. A Pro-A gyöngyöket 30 μl Laemmli-pufferben szuszpendáltuk, 7,5% -os rezolváló gélen SDS-PAGE-nak vetettük alá, és a fent leírtak szerint polivinilidén-difluorid membránokba helyeztük. Ezután a membránokat Western-blottolásnak vetjük alá, és a fehérjéket a fent leírtak szerint vizualizáljuk és mennyiségileg meghatározzuk anti-foszfotirozin (kat. Sz. 02-247; UBT) vagy anti-fosfo IRS-1 Ser 307 (kat. Sz. 02-) alkalmazásával. 247; UBT) mint elsődleges antitest.
Statisztikai analízis.
Az egyváltozós varianciaanalízist minden változónál alkalmazták annak megállapítására, hogy vannak-e szignifikáns különbségek a csoportok között. Amikor jelentős F arányt kaptunk, Tukey HSD post hoc tesztet használtunk a statisztikailag szignifikáns különbségek azonosítására (
Asztal 1. A testtömeg és a zsírpárna tömegű lipideket eltávolítottuk erről az asztalról
Az értékek átlag ± SE. NORCON, normál étrend, kontroll állatok; HFC, magas zsírtartalmú étrend, kontroll állatok; HFX, magas zsírtartalmú étrend, testedzésre edzett állatok; HFRSG, magas zsírtartalmú étrend, roziglitizonnal kezelt állatok; HFRX, magas zsírtartalmú étrend, roziglitizonnal kezelt, testedzést végző állatok.
* Jelentősen eltér a NORCON-tól ( # jelentősen eltér a HFC-től ( A 307 foszforiláció fokozódott a többi állathoz képest ( 307 foszforilációt expresszáltak az IRS-1 fehérjekoncentrációhoz viszonyítva, és azt találták, hogy a szerin foszforilációja megnövekedett (
1. ábra.Az inzulinreceptor szubsztrát-1 (IRS-1) fehérje koncentrációja (A), IRS-1 tirozin (pY; ) és a Ser 307 (pSer) foszforilációja, valamint a pSer és az IRS-1 fehérjekoncentráció aránya (C) inzulinnal stimulált vázizomzatban, amelyet normál étrendből, kontrollból (NORCON) nyernek; magas zsírtartalmú étrend, kontroll (HFC); magas zsírtartalmú étrend, edzésre edzett (HFX); magas zsírtartalmú étrend, roziglitizonnal kezelt (HFRSG); és magas zsírtartalmú étrend, roziglitizonnal kezelt, testedzéssel (HFRX) kezelt állatok. * Jelentősen eltér a NORCON-tól (
Akt2 fehérjekoncentráció.
A citoszolos Akt2 fehérje koncentrációja nem különbözött inzulin hiányában vagy jelenlétében a csoportok között (2. ábraA). Ezenkívül a plazmamembrán Akt2 fehérjekoncentrációja nem különbözött a csoportok között sem inzulin hiányában, sem jelenlétében (2. ábra).
2. ábra.Citoszolos Akt 2 fehérjekoncentráció (A) és a plazmamembrán Akt2 fehérjekoncentrációja () NORCON, HFC, HFX, HFRSG és HFRX állatoktól nyerték. Az értékek átlag ± SE.
aPKCζ és -λ fehérjekoncentráció.
A citoszolos aPKCζ fehérje koncentrációja hasonló volt a csoportok között inzulin hiányában vagy jelenlétében (3. ábraA). Hasonlóképpen, a citoszolos PKCλ fehérje koncentrációja nem különbözött az egyes csoportok között inzulin hiányában vagy jelenlétében, kivéve a HFRX értéket, amely nagyobb volt, mint a NORCON csoporté bazális körülmények között (
3. ábra.Citoszolos atipikus protein kináz Cζ (aPKCζ) fehérje koncentráció és (A) plazma membrán aPKCζ fehérje koncentráció () NORCON, HFC, HFX, HFRSG és HFRX állatokból származnak. * Jelentősen eltér a NORCON-tól (
4. ábra.Citoszolos aPKCλ fehérje koncentráció (A) és a plazmamembrán aPKCλ fehérje koncentrációja () NORCON, HFC, HFX, HFRSG és HFRX állatoktól nyerték. * Jelentősen eltér a NORCON-tól (
Inzulin hiányában a HFC állatok plazmamembránhoz kapcsolódó aPKCζ fehérje koncentrációja alacsonyabb volt (
5. ábra.Citoszolos Akt2 aktivitás (A), plazma membrán Akt2 aktivitás (), citoszolos aPKCζ/λ aktivitás (C) és a plazma membrán aPKCζ/λ aktivitása (D) NORCON, HFC, HFX, HFRSG és HFRX állatoktól nyerték. * Jelentősen eltér a NORCON-tól (
aPKCζ/λ aktivitás.
A citoszolos aPKCζ/λ aktivitás bazális körülmények között hasonló volt a NORCON, a HFC és a HFX között (5. ábraC). A bazális citoszolos aPKCζ/λ aktivitás a HFRSG és HFRX csoportokban megemelkedett (
6. ábra.A citoszolos glükóz transzporter 4 (GLUT4) fehérje koncentrációja (A) és a plazma membrán GLUT4 fehérje koncentrációja () NORCON, HFC, HFX, HFRSG és HFRX állatoktól nyerték. * Jelentősen eltér a NORCON-tól (
Az inzulinnal stimulált szénhidrát-anyagcsere a magas zsírtartalmú állatok vázizomzatában jelentősen károsodott, amit a 3-MG transzport (43) és a plazmamembrán GLUT4 fehérje koncentrációjának csökkenése bizonyít a normál étrendű állatokhoz képest. Ezek a megfigyelések összhangban vannak számos korábbi jelentéssel, amelyek szintén kimutatták, hogy a magas zsírtartalmú étrend csökkenti az inzulin által stimulált glükóz transzportot (4, 8, 20, 21, 37, 39, 49, 54, 56), PI-3 kináz aktivitás (39, 49, 52, 57) és a plazma membrán GLUT4 fehérje koncentrációja (21, 49, 52, 56, 57) a rágcsáló vázizomzatában. Ezenkívül a magas zsírtartalmú állatokban a citoszolos inzulinnal stimulált Akt2 és aPKCζ/λ aktivitás csökkent, bár az Akt2, aPKCζ és az aPKCλ fehérje koncentrációja nem változott. Ezenfelül ezek a megfigyelések összhangban vannak a legutóbbi jelentéssel (23) és más kutatók (30, 39, 52) megfigyeléseivel, akik szintén kimutatták, hogy az Akt2 és az aPKCζ/λ aktivitás csökken a teljes fehérjekoncentráció és a foszforiláció változásának hiányában.
A plazmamembrán fehérje koncentrációját és az Akt2 aktivációját illetően nem találtuk, hogy az inzulin a plazma membránnal társított Akt2 fehérje koncentrációt vagy aktivitást növelte a bazális szint fölé. Ezzel szemben a plazma membrán fehérje koncentrációja és az aPKCζ és -λ fehérje aktivációja a magas zsírtartalmú vázizomban az inzulinra adott válaszként az alapszint fölé emelkedett, de az aPKCζ és -λ, valamint az aPKCζ/A magas zsírtartalmú vázizomzat λ aktivitása kisebb volt, mint a normál étrendű állatoké. Ezek az eredmények összhangban vannak korábbi megfigyeléseinkkel (23).
Összegzésként új bizonyítékokat szolgáltatunk arra vonatkozóan, hogy a magas zsírtartalmú táplálás nem változtatja meg a citoszolos Akt2 vagy az aPKCζ és -λ fehérje koncentrációt a normál étrend fogyasztásához képest. Inkább az inzulinnal stimulált citoszolos Akt2 és aPKCζ/λ aktivitások, az inzulin által stimulált plazmamembránhoz kapcsolódó aPKCζ és -λ fehérje koncentrációk, az aPKCζ/λ aktivitás és a GLUT4 fehérje koncentrációja csökken a magas zsírtartalmú állatokban. Különösen figyelemre méltó, hogy az aerob testmozgás megfordította a magas zsírtartalmú étrend hatásait, így az inzulin által stimulált rekeszek és az inzulinjelző kaszkád komponenseinek aktiválása hasonló volt a normál étrendű kontroll állatokéhoz. A roziglitazon nem fordította vissza a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott glükóz metabolizmus károsodását a vázizomzatban, nem fokozta a testmozgás hatását, sőt egyes esetekben még a testedzés pozitív hatásait is gátolta. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a krónikus testedzés, a rosiglitazon kivételével, visszafordíthatja a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott károsodásokat az inzulin-jelző kaszkád komponenseinek kompartmentalizációjában és aktiválásában a vázizomzatban.
Ezt a tanulmányt az Ausztrál Kutatási Tanács (J. A. Hawley; DP0663862) és a Nemzeti Egészségügyi Intézetek (B. B. Yaspelkis; GM-48680, GM-08395 és DK-57625) támogatásával támogatták.
LÁBJEGYZETEK
A cikk megjelenésének költségeit részben az oldaldíjak megfizetése fedezte. A cikket ezért ezennel fel kell tüntetni:hirdetés”Szerint a 18 U.S.C. Az 1734. § kizárólag ennek a ténynek a feltüntetésére.
Köszönjük a GlaxoSmithKline-nak (Stevenage, Egyesült Királyság) a roziglitazon ajándékát.
Jelenlegi cím D. A. Rivas számára: Gyakorlási anyagcsere csoport, Orvostudományi Kar, RMIT Egyetem, Bundoora, Victoria Australia.