A Vaccinia vírus A27 fehérjéjével szembeni antitestek semlegesítik és védik a fertőzéseket, de
Yong He, Jody Manischewitz, Clement A. Meseda, Michael Merchlinsky, Russell A. Vassell, Lev Sirota, Ira Berkower, Hana Golding, Carol D. Weiss, A Vaccinia Virus A27 fehérjéjével szembeni antitestek semlegesítik és védik a fertőzéseket, de kiskorúakat képviselnek A Dryvax Vaccine-Induced Immunity komponense, The Journal of Infectious Diseases, 196. évfolyam, 7. szám, 2007. október 1., 1026–1032. Oldal, https://doi.org/10.1086/520936
Absztrakt
A himlő vakcina, a Dryvax, amely replikációképes vakcinia vírusból áll, olyan antitesteket vált ki, amelyek nagy szerepet játszanak a védelemben. Számos vaccinia fehérje semlegesítő antitesteket termel, de a védelem szempontjából nem ismert jelentőségük. Megvizsgáltuk az érett virion A27 fehérjével szembeni antitestek hatékonyságát semlegesítési és védekezési kísérletek során, valamint az A27 antitestek hozzájárulását a Dryvax által kiváltott immunitáshoz. Rekombináns A27 fehérje (rA27) alkalmazásával megerősítettük, hogy az A27 tartalmaz semlegesítő determinánsokat, és hogy a Dryvax recipiensektől származó vaccinia immun globulin (VIG) reaktivitást mutat az A27-re. A VIG semlegesítés azonban nem csökkent szignifikánsan, amikor az A27 antitesteket eltávolították, és az rA27 által kiváltott antitestek fokozták a VIG által a passzív transzfer kísérletek során biztosított védelmet. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az A27 antitestek nem képviselik a VIG-ben a semlegesítő aktivitás fő részét, és arra utalnak, hogy az immunitás fokozható olyan vakcinákkal és immunglobulinokkal, amelyek erős antitest-válaszokat tartalmaznak az A27-re.
A bioterrorizmus veszélye új himlőoltási kezdeményezéseket ösztönzött. Noha az USA-ban engedélyezett, himlőoltás, a Dryvax (Wyeth Laboratories), amely replikáció-kompetens vakcinia vírusból (VACV) áll, rendkívül hatékony, biztonsági kockázatot jelent, különösen immunhiányos egyének számára. Javított biztonsági profilú vakcinákat fejlesztenek [1, 2], de ortopox vírus kitörése hiányában a hatékonyság értékelésének az emberi immunválaszoktól és az állatmodellekben alkalmazott védekezési kísérletektől kell függenie [3].
Itt értékeljük a Dryvax által kiváltott A27 antitesteket, és tovább vizsgáljuk az rA27 protektív ellenanyagok indukálásának lehetőségét. Megerősítjük, hogy az rA27 robusztus semlegesítő antitesteket vált ki, és azt is megmutatjuk, hogy az anti-rA27 antitestek részleges védelmet nyújtanak és fokozzák a VIG-t immunhiányos egerekben. Ezenkívül megmutatjuk, hogy a Dryvax anti-A27 semlegesítő antitesteket indukál, de ezek a VIG-ben a teljes semlegesítő aktivitásnak csak kis részét képviselik. Ezek az eredmények bemutatják a poxvírusok elleni immunitás fokozásának lehetőségét olyan megközelítésekkel, amelyek erős humorális válaszokat váltanak ki az A27-re.
ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
Vírusok és sejtek. A West Reserve-t (VACV-WR; ATCC VR-1354) és a β-galaktozidázt expresszáló és funkcionális TK géneket expresszáló Western Reserve-t (VACV-WR; ATCC VR-1354) és vSC56 [27] (B. Moss, National Institute of Health, Bethesda, MD) szaporították és titrálták BS- C-1 sejteket és szacharóz gradiens centrifugálással tisztítottuk [28].
Antitestek és immunizációk. A VIG-t, a Dryvax-immunizált személyek kereskedelmi immunglobulin-készítményét Dr. Dorothy Scott (USA Food and Drug Administration, Rockville, MD) biztosította. Két-hat új-zélandi fehér nyulat szubkután alapozunk 200 µg rA27-gyel vagy konjugálatlan, tisztított peptiddel, Freund teljes adjuvánsával keverve, majd 2–4 100 mg antigént adunk hozzá Freund nem teljes adjuvánsával, 4 hetes időközönként. A szérummintákat 30 percig 56 ° C-ra melegítettük a komplement inaktiválásához. Irreleváns HIV antigén alkalmazásával kontroll immunimmunulinokat készítettünk hasonlóan.
ELISA-k. Az ELISA-vizsgálatokhoz a 96 üreges polisztirol lemezeket (Corning) rA27-gyel vagy 75 pmol peptidekkel (PBS) egy éjszakán át bevontuk, Tris-pufferolt sóoldattal, 0,5% Tween 20-mal (TBS-T) mostuk, és 5% zsírmentes száraz tejjel blokkoltuk. a TBS-T-ben. A szérum vagy immunglobulinok (IgG) sorozatos hígításait 1 órán át 37 ° C-on inkubáltuk, és 1-szer hígított peroxidázzal konjugált nyúl- vagy emberellenes antitesttel (Roche Diagnostics) inkubálás előtt négyszer TBS-T-ben mostuk: 1: 5000. Az oldható 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (BM Blue, POD szubsztrát; Roche Diagnostics) 30 percig történő alkalmazása után a minták abszorbanciáját leolvastuk (optikai sűrűség 450 nm-en). Meghatároztuk, hogy a végpont szérum titer (vagy milligramm kötési egységenként az IgG esetében) a legmagasabb szérum hígítás (vagy az antitest legkisebb mennyisége), amely> 3 SD-nél nagyobb abszorbanciát eredményez a legalacsonyabb hígítású negatív kontroll antitesténél.
Semlegesítési vizsgálat. A semlegesítési titert úgy határoztuk meg, hogy szérumot vagy IgG-hígításokat inkubáltunk Dulbecco módosított Eagle táptalajába, 10% -os magzati borjúszérummal, VACVWR-rel plakkredukciós semlegesítő (PRNT) vizsgálatokban [28]. Röviden: 0,5 ml 100-300 pfu-t tartalmazó VACV-t inkubáltunk antitestek hígításával 30 percig 37 ° C-on, majd a BS-C-1 monorétegeket 12 lyukú lemezeken oltottuk 1 órán át 37 ° C-on, majd 2 alkalommal PBS-sel mossuk, és 2 napig tenyésztjük 37 ° C-on folyadék fedvény alatt. A plakkokat megszámoltuk, miután 0,1% kristálylilával festettük. A semlegesítő titer a szérum hígítás vagy az IgG mennyisége (milligrammban) volt meghatározva, amely ahhoz szükséges, hogy az üregenként lévő plakkok számát 50% -kal csökkentse (Nt50).
A semlegesítés visszavonása. Az IC50-értékhez közeli mennyiségű semlegesítő antitesteket 30 percig keverjük a rA27 jelzett koncentrációjának jelenlétében vagy hiányában, mielőtt vírussal inkubálnánk PRNT-vizsgálatokhoz.
Vaccinia vírus kihívás. Hat 9 hetes nőstény BALB/c AnNcr-nu/nu egérnek intraperitoneális oltást adtunk 1 × 107 pfu tisztított vSC56 törzzsel, amelyet szobahőmérsékleten 30 percig VIG vagy nyúl IgG-vel tisztított antitestekkel kevertünk. Korábbi kísérletek azt mutatták, hogy ez az eljárás konzerválta a védekezéshez szükséges antitestek mennyiségét, összehasonlítva azokkal az eljárásokkal, amelyek egereknek antitesteket adtak az oltás előtt. Az egereket naponta lemértük a fertőzés után, és eutanizáltuk őket, amikor a kezdeti testsúly 25% -át elvesztették. Az összes egeret a CBER Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság szabványainak megfelelően kezeltük.
statisztikai elemzések. A törlési vizsgálatokban összehasonlítható mintákat elemeztünk rA27-gyel és anélkül Student kétfarkú, páros t teszttel. A protekciós vizsgálatokban a log-rank tesztet alkalmazták a csoportok közötti túlélési különbségek jelentőségének meghatározására. Statisztikai elemzések a JMP szoftvert használták (5.1-es verzió; JMP).
EREDMÉNYEK
Az anti-A27 antitestek semlegesítő aktivitása. A funkcionális antitestválaszokat PRNT vizsgálatokban vizsgálták. Az A27 immunogének közül csak az rA27 mutatott erős semlegesítő aktivitást (1. táblázat, felső rész). Az 5 antipeptid szérum kombinációja minden szérum 1:20 hígításával szintén hiányzott semlegesítő aktivitástól (nem látható), ami arra utal, hogy a semlegesítő antitesteket nem eredményezik hatékonyan a peptidek. Noha számos anti-A27 semlegesítő monoklonális antitest megköti a lineáris epitópokat [31, 32], VACV-val történő oltással váltották ki őket [22]. Képtelenségünk a monoklonális antitestek semlegesítésére lineáris epitópokat tartalmazó N26 peptiddel semlegesítő antitesteket előállítani, ami tükrözi a natív A27 konformáció szükségességét a semlegesítő antitestek indukciójához. Összehasonlító vizsgálatokban a VIG és az A27 IgG ~ 20, illetve 1,8 µg/ml IC50-t adott (1. táblázat, alul). Az rA27 IgG látszólag magasabb hatékonysága valószínűleg - legalábbis részben - azt a tényt tükrözi, hogy a PRNT-vizsgálatok csak az MV-t és nem az extracelluláris fertőző vírusokat (EV) értékelik, amelyek általában törékenyek a tenyészállományban.
A VIG frakcionálásához 550 mg tisztított IgG-t alkalmaztunk, amely 6,3x104 kötőegységet és 4,7x104 Nt50 egységet tartalmazott az oszlopra (2. táblázat). Az rA27 IgG-hez hasonlóan az oszlop szinte az összes A27 kötő aktivitást eltávolította a VIG-ben, amelyet az eluátum frakcióban nyertünk fel. Ezzel szemben a semlegesítési aktivitás túlnyomó része (3,6 × 104 Nt50) az átfolyási frakcióban maradt, és 2 Nt50). Ez az eredmény nem az oszlop túlterhelésének volt köszönhető, mert az oszlop sokkal nagyobb mennyiségű A27-specifikus antitest eltávolítására volt képes (2. táblázat). Így a Dryvax vakcina által kiváltott A27-specifikus antitestek semlegesítő hatásúak, de a VIG-ben jelenlévő semlegesítő antitestek csak kis részét képviselik. Hasonlóképpen, amikor tisztított UV-inaktivált MV-vel bevont lemezeken mértük a fajlagos MV reaktivitást a VIG-ben, azt találtuk, hogy a teljes VIG-ben jelenlévő reaktivitás 99% -a az átfolyó frakcióban maradt, és az eluátum frakcióban csak 0,4% volt visszanyerhető (az adatok nem Látható). Ezek az eredmények összhangban vannak a semlegesítési vizsgálatok eredményeivel, amelyek azt mutatják, hogy a Dryvax által indukált antitestek többsége, még azok is, amelyek az MV-t célozzák, nem az A27 ellen irányulnak.
További független kísérletek az A27 antitestek értékelésére a VIG-ben (3. ábra) az antitestek és az rA27 feleslegének összekeverésével jártak, mielőtt a PRNT-vizsgálatokban felhasználnák az A27-specifikus semlegesítő aktivitást. Ez a módszer utánozza az oszlop átfolyó frakcióját, miközben közvetlenül méri a semlegesítést. Az antitesteket az IC50-hez közeli koncentrációban alkalmaztuk az érzékenység maximalizálása érdekében a semlegesítő aktivitás visszavonásának detektálásában (3. ábra, 3., 5. és 7. sáv). Ennek megfelelően, amikor az A27 IgG-t 2 ug rA27-gyel (> 10-szeres moláris felesleg) előzetesen inkubáltuk, a semlegesítő aktivitást 97% -kal megsemmisítettük (3. ábra, 4. sáv). Az A27 IgG egyesítése egyedi A27 peptidekkel vagy kombinációkkal nem csökkentette a semlegesítést (az adatokat nem mutatjuk be). Lényeges, hogy a VIG-vel végzett semlegesítést nem csökkentette szignifikánsan az rA27 feleslegével (20 pg) végzett inkubálás, mielőtt a sejteket beoltották volna a PRNT-vizsgálatokba (3. ábra, 6. sáv). Ahogy az várható volt, az rA27 önmagában nem befolyásolta a fertőzőképességet (3. ábra, 1. és 2. sáv). Megállapítottuk azt is, hogy az rA27 80% -kal csökkentette az A27 oszlopból származó VIG eluátum frakció semlegesítési aktivitását (3. ábra, 8. sáv). Arra a következtetésre jutunk, hogy a VIG tartalmaz neutralizáló antitesteket az A27 ellen, de ezek az antitestek a VIG-ben lévő semlegesítő antitestek nagyon kis részét alkotják.
Védelmi vizsgálatok anti-A27 antitestekkel és VIG-vel. Mivel a PRNT-vizsgálatok csak az MV-kkel szembeni semlegesítő aktivitást mérik, és az EV-ket vélhetően fontosnak tartják a gazdán belüli elterjedés szempontjából, ezért in vivo kísérleteket vállaltunk a poliklonális A27 antitestjeink hatékonyságának további értékelésére és arra, hogy növelhetik-e a VIG-t. Ezek a vizsgálatok az antitestek immunhiányos meztelen egerekbe történő átvitelét és 1 × 107 pfu vSC56-tal, egy timidin-kináz-hiányos VACV-vel történő halálos fertőzést jelentették. Az előzetes kísérletek során meghatározott (az adatokat nem bemutató) immun-globulin-szuboptimális dózisokat használtuk annak értékelésére, hogy lehet-e előnyöket elérni az A27 IgG és a VIG kombinálásával. A VIG vagy az rA27 antitestek alacsony vagy nagy dózisait összehasonlítottuk alacsony dózisú antitestek kombinációjával, amely megegyezett a nagy dózisú VIG teljes mennyiségével (4. ábra). Az antitesteket az IgG teljes mennyiségére, nem pedig a PRNT-aktivitásra normalizáltuk, mert az MV-k és az EV-k elleni semlegesítő aktivitás releváns lenne in vivo.
A 4. ábra mindkét dózisban részleges védelmet mutat be az A27 IgG-vel (8 és 24 mg) és a VIG-vel (4 és 12 mg) kezelt csoportokban, összehasonlítva a csak VACV-t vagy VACV-t kapó kontrollcsoportokkal, amelyeket 24 mg normál nyúl immungglobinnal (NR) kezeltek. IgG) (P 23], de tudomásunk szerint eredményeink az első bizonyíték arra, hogy a rekombináns A27 fehérjével szembeni poliklonális antitestek passzívan védik az immunhiányos állatokat a halálos kihívástól.
Ahogy az várható volt, a VIG az egereket is megvédte a túlélés jelentős kiterjesztésével, összehasonlítva a kontroll csoportokkal (P 5). Ezek a védelmi vizsgálatok azt mutatják, hogy az A27 elleni antitestek fokozhatják a VIG elleni védelmet, és azt sugallják, hogy a jelenlegi oltóanyagok javíthatók az A27 elleni antitest-válasz javításával.
VITA
Az A27 antitest-válaszokat gyakran detektálják a VACV-alapú vakcinákkal végzett immunizálás után [29, 33], de jelentőségük a védelemben nem ismert. Az új himlő vakcinák és terápiás immunglobulinok tervezésének és értékelésének megismertetése érdekében megvizsgáltuk a Dryvax által kiváltott A27-specifikus antitestek hozzájárulását a vírusneutralizációhoz és védelemhez, valamint tovább vizsgáltuk az A27 antitestek potenciálját a védelem fokozásában.
A teljes hosszúságú rA27 hatásos semlegesítő aktivitással rendelkező, magas titerű antitesteket indukált (1. táblázat), amelyek immunhiányos egerekben fokozták a passzív védelmet a VIG-vel (4. ábra). Ezek az eredmények összhangban vannak azon megállapításainkkal, miszerint a Dryvax nem indukál nagy mennyiségű A27 antitestet (2. és 3. ábra). Egy nemrégiben készült, a VACV Lister törzsével immunizált személyek antitest-válaszait vizsgáló jelentés azt is sugallta, hogy az MV-semlegesítést nem az A27 válaszok dominálják, ellentétben az EV-semlegesítéssel, amelyet úgy tűnik, hogy egyetlen fehérje (B5) dominál [34]. További kutatásokra van szükség annak megállapításához, hogy a multiprotein fúziós komplexben potenciálisan részt vevő más fehérjék elleni antitestek a vakcina által kiváltott immunitás fontos elemei-e [35, 36].
Elismerés
Köszönetet mondunk az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatalának, a Biológiai Értékelési Központnak és a kutató kollégáknak Dr. Mike Kennedy, Nancy Eller és Jerry Weir hasznos vitákért és dr. Dot Scott és Margaret Bash a kézirat kritikus elolvasásáért.