Az abszcizinsav krónikus kezelésének hatása neuroinflammatorikus markerekre és patkány memóriájára

Absztrakt

Háttér

A nyugati étrend és életmód a túlsúlyhoz, az elhízáshoz és a 2-es típusú cukorbetegséghez kapcsolódik, amelyek viszont összefüggésben vannak a neuroinflammációs folyamatokkal. A testmozgás és az egészséges táplálkozás fontos e rendellenességek megelőzésében. Azonban a neuroinflammációt gátló molekulák hatékonyak lehetnek a gyulladásos etiológia neurológiai rendellenességeinek megelőzésében és/vagy kezelésében is. Az abszcizinsav (ABA) egy fitohormon, amely részt vesz a hidraulikus stressz válaszokban. Ez a vegyület nemcsak a növényekben található meg, hanem más organizmusokban is, beleértve az emlősöket is. Rágcsálókban az ABA jótékony szerepet játszhat a perifériás immunválasz és az inzulinhatás szabályozásában. Így feltételeztük, hogy a krónikus ABA beadása védőhatást fejthet ki a magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott neuroinflammation modelljében.

Mód

A hím Wistar patkányokat standard táplálékkal vagy HFD-vel etették ABA-val vagy anélkül az ivóvízben 12 hétig. Glükóz tolerancia tesztet és viselkedési paradigmákat végeztünk a kezelések perifériás és központi hatásainak értékelésére. Az egyirányú ANOVA-t a csoportok közötti statisztikai különbségek elemzésével végeztük.

Eredmények

A HFD perifériásan indukálta az inzulinrezisztenciát, és növelte az agy gyulladásos markereinek szintjét. Megfigyeltük, hogy az ABA a várakozásoknak megfelelően helyreállította a glükóz toleranciát a HFD-vel táplált patkányokban. Ezenkívül a krónikus ABA-kezelés megmentette a kognitív teljesítményt ezeknél az állatoknál, miközben nem befolyásolta a kontroll étrenddel etetett állatokat. Ezenkívül ellensúlyozta a HFD által kiváltott változásokat a hipotalamuszban; mikroglia aktivációk és TNFα mRNS szintek.

Következtetés

Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ABA új terápiás molekulává válhat, amely javítja a neuroinflammatorikus állapotot és az inzulinrezisztenciát.

Háttér

Ezenkívül az ABA molekuláris szerkezeti hasonlóságot mutat a retinsavval (RA). Az RA-nak jótékony kognitív hatásai vannak, orvosolva az Alzheimer-kór rágcsálómodelljeinek memóriahiányát. A klinikai és az állatmodell adatai azonban összefüggést mutatnak az RA beadása és a depresszió tünetei között [15]. Az ABA krónikus kezelésének kedvező antidepresszáns hatása van a megnövekedett szacharózbevitel, az erőltetett úszási tesztben történő fokozott úszás és a patkány hipotalamuszában kontroll patkányokban csökkent CRH és RARα mRNS expressziója mellett, jelentett mellékhatások nélkül [16]. Sőt, az előzetes adatok javított térbeli memóriát mutatnak ABA-val kezelt patkányokban [17]. Ezen adatok alapján feltételeztük, hogy mivel az ABA képes modulálni a perifériás inzulinrezisztenciát és az immunválaszt, központilag is hasonló hatást gyakorolhat. Így ennek a munkának a célja annak bemutatása, hogy az étrendi ABA képes-e helyreállítani a magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott ideggyulladás okozta kognitív hiányokat. A HFD emeli az agyban a neuroinflammation markerek szintjét [18], és kapcsolatot teremthet az elhízás és az inzulinrezisztencia révén a degeneratív rendellenességek között [19]. Továbbá, a HFD kimutatta, hogy memóriavesztést okoz a gyulladásos markerek emelkedésével a hippocampusban [20].

Az ivóvízben ABA-t (20 mg/l) adtunk patkányoknak HFD-vel vagy standard táplálékkal (SD). Tizenegy hetes kezelés után összehasonlítottuk a négy csoport viselkedését két memória-paradigma felhasználásával: az új tárgyfelismerés (NOR) és a T-labirintus. Ezenkívül HPLC-vel mértük mind a négy csoport ABA-szintjét a vérben és a kisagyban. Immunhisztokémiai módszerrel elemeztük a mikroglia proliferációt. Kimutattuk, hogy az ivóvízben beadott ABA javította a glükóz toleranciát és a kognitív teljesítményt, és csökkentette a gyulladásos markerek szintjét a hipotalamusz területén. Eredményeink megerősítik ennek a fitohormonnak a terápiás potenciálját a perifériás metabolikus változásokban. Az adatok határozottan utalnak az ABA potenciális jótékony hatásaira a neuroinflammatorikus etiológia rendellenességeiben is, amelyet korábban nem igazoltak.

Mód

A kísérlet célja a fitohormon, az ABA központi hatásainak értékelése a HFD által kiváltott neuroinflammáció modelljében, 12 hetes kezelés alatt. A viselkedési tesztek a 11. héten kezdődtek, az ABA és a diétás kezelés 12. hetében áldozatokat hajtottak végre (1. ábra).

Kísérlet tervezés. A viselkedési tesztek a 11. héten kezdődtek, az állatokat a 11. és 12. héten feláldoztuk

Állatok és étrend

Új tárgyfelismerés (NOR)

T-labirintus

A T-labirintus háromkaros labirintus volt; az egyik kar (119,3 × 18,2 cm) hosszabb volt, mint a másik kettő, amelyek azonosak voltak (21,1 × 34,5 cm); az egész labirintus a padló fölé került. A hosszabb kart választották kiinduló karnak. A patkányokat a viselkedési szobába 30 percig szoktattuk. A tesztnapon az állatokat 5 percig hagyták felfedezni a labirintust, hozzáféréssel a három kar közül kettőhöz (az otthoni vagy a kezdőkarhoz és az ismert karhoz). A patkányt ezután 2 órás intervallum-intervallumra (nehéz feladatcsoport) vagy 90 perces inter-próbára (könnyű feladatcsoport) visszahelyezték háziketrecébe, amely során a labirintust 30% -os etanollal megtisztították. A patkányt ezután visszatették az útvesztőbe; ezúttal az állat 5 percig hozzáférhetett az összes karhoz [24]. Az új karba történő bejegyzések számát és az egyes karokban eltöltött időt videokövető rendszer segítségével rögzítettük (Smart 2.5.19).

Glükóz tolerancia teszt

A patkányokat egy éjszakán át éheztettük, és egy csepp vért vettünk a farokból (t = 0), valamint 30 perc (t = 30) és 120 perc (t = 120) után glükóz beadása után (2 g/kg). A plazma glükózszintjét Glucomen LX Plus glükométerrel mértük.

HPLC ABA mérések

Az ABA-t mind a négy csoportban LC/ESI-MSMS alkalmazásával elemeztük, lényegében a [25] -ben leírtak szerint, kis módosításokkal. Röviden, 1 g fagyasztott szövetet extraháltunk tiszta vízben szövethomogenizátor (Ultra-Turrax, Ika-Werke, Staufen, Németország) alkalmazásával, miután 100 ng d 6. -ABA. Az extrakció és a centrifugálás után a felülúszó pH-ját 3,0-ra állítottuk be, és kétszer megosztottuk dietil-éterrel (Panreac, Barcelona, Spanyolország). A szerves rétegeket egyesítjük és centrifuga vákuum-bepárlóban bepároljuk (Jouan, Saint-Herblain, Franciaország). A száraz maradékot ezután víz/metanol (9: 1) oldatban szuszpendáljuk, szűrjük és egy UPLC ™ Acquity rendszerbe (Waters, Milford, MA, USA) injektáljuk. Az analitot ezután egy fordított fázisú UPLC C18 oszlopon választottuk el (Nucleodur C18, 1,8 μm, 50 × 2,0 mm, Macherey-Nagel, Barcelona, Spanyolország). Az oldószereket metanollal és 0,01% -os ecetsavval kiegészített vízzel adtuk 300 µl/perc áramlási sebességgel. Az ABA mennyiségét egy Quattro LC triple quadrupole tömegspektrométerrel (Micromass, Waters, Manchester, UK) kvantitatív módon csatlakoztattuk az oszlop kimenetéhez egy ortogonális Z-spray elektrospray ionforráson keresztül. Ennek a hormonnak a mennyiségét külső kalibrálással érték el, ismert mennyiségű standarddal.

Immunocitokémia (ICC)

A patkányokat pentobarbitál (120 mg/kg Eutanax, Fatro, Barcelona, Spanyolország) túladagolásával altattuk és transzkardiálisan sóoldattal (0,9%) perfúzióval, majd 4% paraformaldehid (PFA) fixálóval 0,1 M foszfátpufferben, pH 7,4. A perfúzió után az agyakat eltávolítottuk a koponyákról, és egy éjszakán át fixáltuk 4 ° C-on PFA-ban. Ezután az agyakat 30% -os szacharózba merítettük 48 órán keresztül a krioprotektív védelem érdekében. Csúszó mikrotóm Leica SM2010R (Leica Microsystems, Heidelberg, Németország) 40 μm vastag koronás fagyasztott szakaszok előállításához használtuk. Az agyakat rostrocaudalis irányba vágtuk; hat szelet sorozatot gyűjtöttek mindegyik agyból, és elemzés céljából -20 ° C-on tárolták.

RNS extrakció és RT-PCR

Eredmények

Az állatokat lemértük, a víz és az élelmiszer-fogyasztást hetente kétszer ellenőriztük. A viselkedési tesztek a 11. héten kezdődtek, az ABA és a diétás kezelés 12. hetében áldozatokat hajtottak végre (1. ábra). Ahogy az várható volt, a túl táplálkozás hatással volt a testtömegre, de az ABA beadása egyik csoportban sem befolyásolta a súlygyarapodást. Az eredményeket átlagként ± SE ( = Csoportonként 16). Az SD-vel etetett kontroll állatok testtömegüket 444 ± 11,7 g-ról (1. hét) 585 ± 12,0 g-ra (10. hét) növelték. Hasonlóképpen, az ABA-val kiegészített SD-vel kezelt állatok testtömegüket 446 ± 10,7 g-ról (1. hét) 593 ± 10,2 g-ra (10. hét) növelték. Ez 132 ± 2,4% -os és 133 ± 1,5% -os növekedést jelent SD-re, illetve SD-re ABA-val. A HFD-vel és a HFD-ABA-val etetett állatok testtömege azonban 448 ± 11,7 és 453 ± 12,2 g-ról (1. hét) 659 ± 16,0 és 669 ± 16,2 g-ra (10. hét) nőtt, ami 148 ± 3,2% és 148 ± 2,8% (2a. Ábra). Az adatokat kétirányú ANOVA segítségével elemeztük; idő (F (10 600) = 994, o 2. ábra

Beszámoltak arról, hogy az étkezési ABA, amelyet az élelmiszer-pelletek (100 mg/kg élelmiszer) adnak, javíthatja a glükóz toleranciát [21]. Annak megerősítésére, hogy modellünkben az ABA (20 mg/l ivóvíz) javította a glükóz homeosztázisát, éhgyomri állatokon glükóz intolerancia injekciót végeztünk glükóz intraperitoneális injekcióval (2 mg/kg). 11 hetes kezelés után az állatok egy éjszakán át (12–13 óra) éheztek. Az alap glükózszint minden csoportban hasonló volt; 30 perccel a glükózinjekció után a vércukorszint emelkedett. Nem figyeltünk meg szignifikáns különbségeket a csoportok között. Az injekció beadása után két órával azonban a HFD csoportban a glükózszint magasabb maradt (235,4 ± 36 mg/dl), mint a HFD-ABA csoportban (158,9 ± 11,23 mg/dl). Ez utóbbi csoportban a glükózszint hasonló volt a kontrollcsoportokéhoz, SD (143,9 ± 10,24 mg/dl) és SD-ABA (152,6 ± 15,52 mg/dl). Az adatokat egyirányú ANOVA alkalmazásával elemeztük, Newman – Keuls post-hoc teszttel (o 3. ábra

A HFD memóriazavarokat okozhat rágcsálókban [26] és emberekben [27]. A krónikus ABA alkalmazás kognitív teljesítményre gyakorolt hatásának vizsgálatához az állatokat két viselkedési paradigmának vetették alá, amelyek értékelik a rágcsálók memóriáját, az NOR és a T-labirintus tesztet. A NOR kiaknázza a rágcsálók által bemutatott új tárgyak veleszületett feltárási preferenciáját. Ez a paradigma azt vizsgálja, hogy az állat képes-e emlékezni egy ismert tárgyra, amikor újjal mutatják be. Nem figyeltünk meg szignifikáns különbségeket az azonos objektumok feltárására fordított idő alatt az ismerkedési szakaszban (4a. És c. Ábra). A teszt során mind a négy csoport sokkal több időt töltött az új tárgy feltárásával, mint a megszokott, és sem a diéta, sem az ABA kezelés nem változtatta meg ezeket a paramétereket (4b. Ábra). Különbségeket figyeltünk meg azonban, amikor mind az ismerkedési, mind a tesztidő 3 percre csökkent. A HFD csoportban a megszokott és újszerű objektumok időpontja nem különbözött szignifikánsan, ami arra utal, hogy a megszokott objektumra emlékezünk. A HFD-ABA állatok ugyanúgy viselkedtek, mint a kontroll csoportok (SD és SD-ABA), jelezve, hogy az ABA felszámolhatja a HFD által kiváltott károsodást (4d. Ábra).

A T-labirintus teszt során mindkét labirintusba bejegyeztük a bejegyzések számát, amelyek közül az egyik ismerős, a másik újszerű, mert a megszokás során bezárták. Megfigyeltük, hogy az SD-vel, SD-ABA-val és a HFD-ABA-val táplált patkányoknál szignifikánsan több volt a bejegyzés az új karba, mint az ismerősbe. Ez nem csak a HFD-vel táplált állatokra vonatkozott, ami arra utal, hogy ez a diéta ronthatja az ismert kar memóriáját (5a. Ábra). Az adatokat párosítatlan Student-ek segítségével elemeztük t-teszt, a megszokott és újszerű kar összehasonlítása; *o 5. ábra

A vér és az agy (kisagy) ABA-szintjét HPLC-vel mértük. Változó mennyiségű keringő ABA-t detektáltunk kezelt állatokban. Azonban nem tudtuk azonos körülmények között kimutatni az ABA-t kezeletlen állatokban, ami megerősítette, hogy valóban exogén ABA-t figyeltünk meg (2. táblázat). Beszámoltak arról, hogy az intraperitoneális injekciók után az ABA széles körben elterjedt az agyban [17]. Annak megállapítására, hogy az ABA átlépi-e a vér-agy gátat modellünkben, őrszemként mértük az ABA szintjét a kisagyban. A szérumvizsgálathoz hasonlóan az ABA-t csak a kezelt állatok agyában mutatták ki (2. táblázat). Érdekes, hogy a keringő ABA csak nagyon kis része lépi át a vér-agy gátat. Így megerősítettük, hogy az ABA ivóvízben történő beadásának módszere megfelelő volt a lehetséges perifériás hatások mérésére; a vegyület átjuthat az agy – vér gáton, és felelős lehet a megfigyelt viselkedési változásokért.

Ezután megmértük az agy gyulladásos markereinek szintjét. Immunhisztokémia segítségével detektáltuk az Iba1 [28] mikroglia-specifikus citoplazmatikus markert a hipotalamuszban (6a. Ábra). Megfigyeltük, hogy a mikroglia sejtek száma szignifikánsan megnőtt a HFD-vel táplált patkányok patkány hipotalamuszában (1613 ± 260,5 sejt/mm 2), összehasonlítva az SD-vel táplált kontrollokkal (754 ± 135,2 sejt/mm 2). Az ABA kezelés csökkentette ezt a hatást a HFD állatokban (888 ± 158,8 sejt/mm 2), de nem érintette az SD-vel táplált állatokat (794 ± 178,4 sejt/mm 2) (6b. Ábra; egyirányú ANOVA, o = 0,0135). A hipogamusz mikroglia reprezentatív képeit a 6. ábra mutatja (HFD, 6c. Ábra; HFD-ABA, 6d. Ábra; SD, 6e. Ábra; és SD-ABA, 6f. Ábra). A HFD csoportban az Iba1-pozitív sejtek számának növekedésétől eltekintve a mikroglia sejtek kevésbé elágazódtak és több amoeboid volt, mint a kontrollokban, ami jelzi az aktivált állapotot (képbetétek).

Ezután megvizsgáltuk a gyulladásos és gyulladáscsökkentő citokinek szintjét a hipotalamuszban. A hipotalamust leválasztottuk az összes csoportról, és a teljes RNS-t izoláltuk. Kvantitatív PCR-t hajtottunk végre a különböző citokinek expressziós szintjének meghatározására. Megfigyeltük, hogy a TNF-α szintek növekedtek a HFD-vel táplált patkányok hipotalamuszában a kontrollokkal összehasonlítva, megerősítve a meglévő jelentéseket [29, 30]. Az ABA beadása visszaállította a TNFα szintet a kontrollértékekre (7. ábra). Másrészt nem találtunk szignifikáns különbséget a hippocampusban, azonos feltételek mellett, mind a négy csoportban (az adatokat nem mutatjuk be).

Vita

A túlzott energiafogyasztás az elhízás egyik fő oka, amelyet a nyugati társadalmakban az emberi egészség egyik legnagyobb fenyegetésének ismernek el. Úgy tűnik, hogy a hipotalamusz idegsejtjeinek működési hibája a metabolikus megbetegedések hátterében áll [31]. Annak ellenére, hogy az elhízás (a testzsír feleslege) és a neurodegeneráció közötti kapcsolat nagyon összetett, sok forrás összekapcsolja az elhízást és a magas zsírfogyasztást bizonyos neurodegeneratív folyamatokkal [19]. Egyre több bizonyíték bizonyítja, hogy a HFD inzulinrezisztenciát, immunológiai és szinaptikus változásokat vált ki a különböző agyterületeken [32, 33] és kognitív károsodást [34].

Az állatok elhízási modelljeiben az ABA fitohormon, amely szerkezetileg az inzulinszenzibilizátorokkal (TDZ) és a memóriajavító molekulákkal (például retinsavval) függ össze, enyhíti a 2-es típusú cukorbetegség tüneteit. A PPAR-y-t a TDZ antidiabetikus gyógyszerek osztályához hasonló módon célozza meg [21, 35]. Ebben a tanulmányban először mutatjuk be, hogy az ABA képes ellensúlyozni a HFD által kiváltott neurológiai hatásokat (kognitív károsodás és neuroinflammation markerek). Mi, ebben a tanulmányban és mások azt tapasztaltuk, hogy az ABA képes átjutni a vér-agy gáton, de továbbra is megfoghatatlan, hogy a kognitív funkciók javulását az ABA közvetlen agyi hatása okozza-e.

A NOR munkamemória teszt során minden csoport, beleértve a HFD csoportot is, képes volt megkülönböztetni a regényt és az ismert tárgyat. Amikor azonban az ismerkedési és tesztfázisokban töltött idő lerövidült, ezáltal csökkentve/ártva a megszerzési fázisnak, a HFD-vel táplált állatok hasonló időt töltöttek a regény és az ismert tárgy feltárásával. Ez azt jelezte, hogy már nem emlékeztek az ismert tárgyra. Ezt a viselkedést az ABA-kezelés hatékonyan ellensúlyozta. Az ABA-val kezelt állatok más csoportok tagjaihoz hasonlóan viselkedtek, és lényegesen több időt töltöttek az új tárgy feltárásával.

Az ABA központi idegrendszeri gyulladáscsökkentő hatásainak tesztelésére megmértük a hipotalamusz és a hippokampusz citokinszintjét. Az aktivált mikroglia szintetizálja és szekretálja a proinflammatorikus citokineket, például a TNFa-t [60]. Megfigyeltük a TNFα szint növekedését a HFD-vel táplált patkányok hipotalamuszában. Az ABA-kezelés megmentette ezt a hatást, csökkentve a TNFα-t a kontroll szintre. Ellentétben más vizsgálatokkal, ahol a gyulladásos markerekről kiderült, hogy növekednek a hippocampusban, nem találtunk szignifikáns különbséget a TNF-α gyulladásos markerekben HFD-kezeléssel összehasonlítva a kontroll csoportokkal. Feltételezzük, hogy nemcsak a hippocampus neuroinflammációja áll a kognitív zavarok hátterében.

Következtetés

Összefoglalva azt tapasztaltuk, hogy az ABA krónikus kezelése csökkentette a HFD által kiváltott mikroglia aktiválódást a hipotalamuszban, amint az Iba-1 festéssel kiderült. Ezenkívül a TNF-α szintje megváltozott a HFD-vel táplált állatok hipotalamuszában, és ezeket a változásokat az ABA beadása ellensúlyozta. Sőt, az ABA enyhítette a kognitív teljesítmény HFD által kiváltott károsodásait. A hipotalamuszban nem találtunk változást a neuroinflammatorikus markerekben. Ebben a tanulmányban megmutatjuk, hogy a hipotalamusz gyulladása korrelálhat a kognitív teljesítmény enyhe változásaival. Végül eredményeink alapján arra a következtetésre jutunk, hogy az ABA védőhatással bír neuroinflammationos állapotokban, csökkenti a mikroglia és a TNFα szintjét, és helyreállítja a kognitív funkciót. Tekintettel arra a tényre, hogy az ABA átjuthat a vér-agy gáton; feltételezzük, hogy ennek a molekulának potenciális terápiás értéke lehet a neuro-gyulladásos etiológiájú betegségek kezelésében.