Az elhízással összefüggő bélmikrobiota a Lactobacillus reuteri-ben gazdagodik és kimerül
Absztrakt
Háttér:
Az elhízás fokozott egészségügyi kockázattal jár, és a baktériumok bél mikrobiotájának megváltozásával társul, főleg a Bacteroidetes, de nemzetségi és faji szinten kevés adat áll rendelkezésre. Beszámoltak arról, hogy a Lactobacillus és Bifidobacterium a nemzetség képviselőinek kritikus szerepe lehet a súlyszabályozásban, mint elhízás elleni hatás a kísérleti modellekben és az emberekben, vagy növekedés-ösztönző hatás a mezőgazdaságban a törzsektől függően.
Célok és módszerek:
A bejelentett bélelváltozások megerősítése és annak tesztelése, hogy Lactobacillus vagy Bifidobacterium az emberi bélben található fajok elhízással vagy sovány státusszal társulnak, 68 elhízott és 47 kontroll székletét elemeztük Firmicutes, Bacteroidetes, Methanobrevibacter smithii, Lactococcus lactis, Bifidobacterium animalis és hét faja Lactobacillus kvantitatív PCR-rel (qPCR) és tenyésztéssel a Lactobacillus-szelektív közeg.
Megállapítások:
A qPCR-ben, B. animalis (esélyhányados (OR) = 0,63; 95% konfidencia intervallum (CI) 0,39–1,01; = 0,056) és M. smithii (OR = 0,76; 95% CI 0,59–0,97; = 0,03) normál testsúlyhoz társultak, míg Lactobacillus reuteri (OR = 1,79; 95% CI 1,03–3,10; = 0,04) elhízással társult.
Következtetés:
Az emberi elhízással járó bél mikrobiota kimerült M. smithii. Néhány Bifidobacterium vagy Lactobacillus fajok normál testsúlyhoz kapcsolódtak (B. animalis) míg mások (L. reuteri) elhízással jártak. Ezért a bél mikrobiotájának összetétele faji szinten összefügg a testtömeggel és az elhízással, ami fontos lehet a további vizsgálatok és az elhízás kezelése szempontjából. Ezeket az eredményeket óvatosan kell mérlegelni, mert ez a mai napig az első tanulmány, amely összekapcsolja az egyes fajokat Lactobacillus az emberek elhízásával.
Bevezetés
Az elhízás, amelyet 30 kg m −2 feletti testtömeg-indexként (BMI) definiálnak (1. hivatkozás) és a zsír tömeges terjeszkedése, jelentősen megnövekedett halálozással függ össze, és számos betegség, köztük a cukorbetegség, a magas vérnyomás rizikófaktora., légzési rendellenességek, iszkémiás szívbetegségek, stroke és rák. Az elhízás átvihető betegségnek tekinthető, mivel az anyai elhízás hajlamosítja a gyermekeket a felnőttkori elhízásra. 4 Elterjedtsége folyamatosan növekszik a felnőttek, a serdülők és a gyermekek körében, és 1960 óta megduplázódott; és az elhízást ma már világméretű járványnak tekintik, mivel például Észak-Amerika lakosságának több mint 30% -a elhízott. A WHO adatai szerint az elhízás jelenleg világszerte legalább 400 millió embert érint, és 1,6 milliárd túlsúlyos. A WHO további tervei szerint 2015-re ∼ 2,3 milliárd felnőtt lesz túlsúlyos, és több mint 700 millió elhízott. 5 Az elhízási járvány okai összetettek, és környezeti, genetikai, idegi és endokrin eredetűek. 6.
Újabban az elhízás a bakteriális bél mikrobiota specifikus profiljához kapcsolódik, ideértve a Bacteroidetes/Firmicutes aránya 7, 8, 9, 10 és a csökkenés Methanobrevibacter smithii, a bélmikrobiota archaea vezető képviselője. 11 Ezen úttörő tanulmányok óta jelentős összefüggéseket találtak egyes baktériumcsoportok növekedése és az elhízás között (Lactobacillus, 12. Staphylococcus aureus, 13, 14, 15 Escherichia coli, 15 Faecalibacterium prausnitzii 16). Ezzel ellentétben más csoportok is társulnak a sovány státushoz, főként a Bifidobacterium nemzetség. 11, 13, 14, 15, 16 A mai napig ellentmondásos tanulmányok egyértelművé teszik, hogy a mikrobiom és a túlsúly közötti kapcsolat összetett. 17.
Ahány probiotikus törzs Lactobacillus és Bifidobacterium emberi fogyasztásra szánt termékekben forgalmazzák, megváltoztatva a bélflóra 18 és stimulálva az őshonos laktobacillusok és bifidobaktériumok törzseit, 19 feltételeztük, hogy a probiotikumok széles körű fogyasztása elősegítheti az elhízást a bélflóra megváltoztatásával. 20, 21, 22 Ez azonban továbbra is ellentmondásos. Az emberi fogyasztásra szánt probiotikumok és az elhízás közötti kölcsönhatások tisztázásának első lépéseként csak néhány tanulmány hasonlította össze az elhízott és a sovány Lactobacillus és Bifidobacterium nemzetségek a 13., 16. faj szintjén, és valószínűleg nem tudtak kimutatni jelentős különbségeket, valószínűleg a túl kicsi minta miatt. Ennek eredményeként a minta méretének növelésével elemezzük az emésztőrendszer mikrobiotájának összetételét Firmicutes, Bacteroidetes, az archeák M. smithii, Lactobacillus nemzetség, L. lactis, és feltárja a hét kiválasztott faj közötti kapcsolatokat Lactobacillus és az egyik faja Bifidobacterium, emberi fogyasztásra és elhízásra szánt probiotikumok másutt használják.
Anyagok és metódusok
Etika, résztvevők és minták
A bél mikrobiotájának elemzése
Kultúra a konkrét Lactobacillus közepes (LAMVAB tápközeg)
Szobahőmérsékleten történő felolvasztás után 100 mg székletet szuszpendáltunk 900 μl cisztein – pepton – víz 26-os oldatban, és homogenizáltuk. Sorozatos hígítást végzünk foszfáttal pufferolt sóoldatban. Az 1/10-re és 1/1000-re hígított mintákat 10 μl-es oltási hurok segítségével oltottuk be LAMVAB-táptalajon. 27 72 órás üvegekben (AnaeroPack, Mitsubishi Gas Chemical America, Inc., New York, NY, USA) anaerob légkörben (GasPak EZ Anaerobe, Becton Dickinson, Heidelberg, Németország) 37 ° C-on történő inkubálás után a morfotípusokat azonosítottunk, és morfotípusonként 1–4 kolóniát helyeztünk egy polírozott acélból készült MTP 384 céllemez négy pontjára (Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Németország), és triptikáz esetekben tároltuk szója táptalajban (AES, Bruz, Franciaország). ).
Lactobacillus törzsgyűjtemény és MALDI-TOF spektrum adatbázis
A Lactobacillus Laboratóriumunk törzsgyűjtését a Pasteur és a DSMZ gyűjtemény törzsei tették teljessé, és referencia spektrumokat készítettünk a Bruker adatbázisból hiányzóakból. A baktériumok azonosítását Autoflex II tömegspektrométerrel (Bruker Daltonik GmbH) végeztük. Az adatokat automatikusan gyűjtöttük a Flex control 3.0 és a Maldi Biotyper Automation Control 2.0 segítségével. (Bruker Daltonics GmbH). Az egyes izolátumokhoz kapott nyers spektrumokat standard mintaillesztéssel (alapértelmezett paraméter-beállításokkal) elemeztük a referencia-adatbázisként használt fajok spektrumaival szemben. Az izolátumot akkor tekintették helyesen azonosítottnak faji szinten, amikor legalább egy spektrum pontszáma ⩾ 1,9, és egy spektrum a 1,7 volt. 28 A módszer reprodukálhatóságát 10 minta duplikált elemzésével értékeltük.
Kvantitatív valós idejű PCR M. smithii, Bacteroidetes, Firmicutes és Lactobacillus nemzetség
A székletből DNS-t izoláltak a Dridi-ben leírtak szerint et al. A megtisztított DNS-mintákat 100 μl végtérfogatra eluáltuk, és az elemzésig -80 ° C-on tároltuk. A valós idejű PCR-t Stratagene MX3000 rendszeren (Agilent, Santa Clara, Kalifornia, USA) végeztük QuantiTect PCR keverékkel (Qiagen, Courtaboeuf, Franciaország), az előzőekben leírtak szerint. 12.
Kvantitatív valós idejű PCR specifikus Lactococcus lactis, Bifidobacterium animalis és hét Lactobacillus faj
Statisztikai analízis
Először is a Lactobacillus-A specifikus tenyészetet és a kvantitatív PCR-t (qPCR) összehasonlítottuk a két csoportban (elhízott és kontrollcsoport) Fisher-pontos teszt alkalmazásával, az arányok összehasonlításakor, és a Mann – Whitney-tesztet a baktériumok koncentrációinak összehasonlításakor. A különbséget akkor tekintették statisztikailag szignifikánsnak, amikor 30 Logisztikai regressziós elemzésen alapuló másodlagos elemzést alkalmaztunk annak meghatározására, hogy mely kultúraváltozók (Lactobacillus fajkoncentráció), ha elhízással jár. Az adatelemzéseket az SPSS v.9.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) segítségével végeztük.
Eredmények
Betegek
Összesen 115 alany (68 elhízott beteg és 47 kontroll) került be. Tizenhárom elhízott alany és kilenc kontroll volt a laboratóriumunkban végzett korábbi vizsgálat része. 12 A két populáció nemében és magasságában homogén volt, életkora azonban nem (1. táblázat).
Kultúra
A mennyiség meghatározása L. paracasei, L. plantarum és L. reuteri tenyészetben (LAMVAB táptalaj) −log (kolóniaképző egységek az ürülék ml-jében) —Mann – Whitney-teszt.
Firmicutes, Bacteroidetes, M. smithii és Lactobacillus fajspecifikus qPCR
M. smithii a kontrollokban gyakrabban találtak (40/45 (89%) vs 50/67 (75%), Fisher pontos tesztje, = 0,05). Az elemzés valóban talált alacsonyabb koncentrációt M. smithii elhízott alanyokban (Mann – Whitney teszt, = 0,002; Táblázat) és magasabb koncentrációja Lactobacillus (Mann – Whitney-teszt, = 0,04). Bacteroidetes alacsonyabb koncentrációban találtak elhízottaknál, de ez az eredmény nem volt szignifikáns (Mann – Whitney-teszt, = 0,25) (2. ábra). Ugyanezeket az eredményeket találtuk a közös alanyok korábbi vizsgálatunkból való kizárása után (Mann – Whitney-teszt; magasabb Lactobacillus nemzetség elhízott embereknél, = 0,026; alacsonyabb szintje M. smithii, = 0,008 és alacsonyabb Bacteroidetes, = 0,09).
A mennyiség meghatározása Bacteroidetes, Firmicutes, M. smithii és Lactobacillus nemzetség qPCR-vel - Mann – Whitney-teszt.
Bifidobacterium-Lactococcus-Lactobacillus fajspecifikus qPCR
A mennyiség meghatározása B. animalis, L. casei/paracasei, L. plantarum és L. reuteri qPCR-Mann – Whitney teszt segítségével.
Logisztikai regresszióanalízis
A qPCR eredmények logisztikai regressziós elemzésének eredményeit az 5. táblázat mutatja be. A végső modellre alkalmas változókat L. casei/paracasei, L. reuteri, L. gasseri, B. animalis, M. smithii és az életkor. A végső többszörös logisztikai regressziós modell azt mutatta, hogy az életkorhoz való igazodás után, L. reuteri, B. animalis és M. smithii jelentősen összefüggenek az elhízással. L. reuteri volt az egyetlen, amely magasabb szintet mutatott az elhízott egyéneknél, míg B. animalis és M. smithii nem elhízott alanyoknál magasabb szinten találtak.
Vita
Tudomásunk szerint a legnagyobb eset-kontroll tanulmányról számolunk be, amely az emberi elhízott bél mikrobiotáját hasonlítja össze az erre összpontosító kontrollokkal Archaea, Bacteroidetes, Firmicutes, Lactobacillus nemzetség, Lactococcus lactis és B. animalis és először kultúrától és kultúrától független módszert alkalmaztunk a Lactobacillus fajonként az elhízott és a normál testsúlyú emberek között. Eredményeink megerősítik az elhízott bél mikrobiota globális változását alacsonyabb szinttel M. smithii amint arról a szakirodalom már beszámolt, 11 és újonnan az alacsonyabb szintű B. animalis, L. paracasei, L. plantarum és magasabb szintű L. reuteri elhízott bél mikrobiotában.
Csökkenése Bacteroidetes ez volt az első olyan változás, amely jelentősen társult az elhízással, amint azt Ley és Turnbaugh (8) egerekben és észak-amerikai egyénekben (7, 9 és Santacruz) et al., 15, akik túlsúlyos terhes nőket figyeltek meg Spanyolországban. Ugyanezt a korrelációt találtuk korábbi vizsgálatunkban, 12 és ugyanazt a hatásirányt a jelen tanulmányban is, ugyanazzal a PCR-rendszerrel az egész populációra és a közös alanyok kizárása után. Schwiertz et al. 11 ellentétes eredményekről számolt be, de a módszertan kifogásolható volt, mert a Bacteroidetes arányt összegzéssel nyertük Bacteroides és Prevotella nemzetségek. Más vizsgálatok nem találtak kölcsönhatást a relatív vagy abszolút bőség között Bacteroidetes és az elhízás. 31, 32, 33
Korábbi tanulmányunkban 12 bőséges M. smithii szignifikánsan magasabb volt anorexiás betegeknél, de sovány kontrollokban nem. Ebben az új tanulmányban azt találtuk M. smithii ritkábban és szignifikánsan kevésbé gyakoriak voltak elhízott betegeknél a teljes populációban és a közös alanyok kizárása után. Schwiertz et al. 11 egy speciális qPCR használatával Methanobrevibacter faj, hasonló eredményeket talált egy német populációban. Ezek az eredmények ellentmondanak a Zhang eredményeinek et al. 33 aki megtalálta Methanobacteriales csak elhízott egyéneknél volt jelen qPCR-t használva, de csak három elhízott és három kontrollt hasonlítottunk össze.
L. plantarum és L. paracasei a normális testsúlyhoz kapcsolódtak a tenyészetekben, összhangban az irodalom kísérleti modelljeivel, amelyek az elhízás elleni hatásról számoltak be L. plantarum egerekben. 37 Egyéb Lactobacillus törzsek hasonló elhízás elleni hatást mutattak ki állatokban és emberekben, mint a L. gasseri SBT2055 (LG2055) törzs sovány Zucker patkányokban 38 és emberekben. Ez az elhízás elleni hatás olyan specifikus molekulák előállításához köthető, amelyek zavarhatják a gazdaszervezet anyagcseréjét, például konjugált linolsav (CLA) L. plantarum vagy L. rhamnosus. 37, 40 In vivo és in vitro a CLA által a fehérje és a génexpresszió fiziológiai módosításainak elemzése azt sugallja, hogy a CLA delipidáló hatását az energiafogyasztás, az apoptózis, a zsírsav oxidáció, a lipolízis, a stromalis vaszkuláris sejtek differenciálódása és a lipogenezis modulálásával fejti ki. 37 A konjugált linolsav és az elhízás elleni hatásokat összekötő mechanizmusokat vizsgáló szerzők beszámoltak a szétkapcsoló fehérjéket kódoló gének (UCP-2) szabályozott expressziójáról, amely elsődleges mechanizmus lehet, amely révén a CLA növeli az energiafelhasználást és elhízás elleni hatást eredményez. hatás. 40
L. reuteri összefüggésbe hozták itt az elhízással. L. reuteri az egyik legtöbbet vizsgált probiotikus faj, különösen azon képessége miatt, hogy más potenciálisan patogén mikroorganizmusok szaporodását gátolja azáltal, hogy szekretál antibiotikumokat, például reuterint. 41 Sertésekben, pulykákban és patkányokban történő bevitel esetén, L. reuteri jelentős súlygyarapodáshoz vezetett, és probiotikus beadás után nagyobb koncentrációban izolálták a székletből. 42, 43, 44 A mechanizmus, amellyel L. reuteri képes támogatni ezen állatok egészséges növekedését, nem teljesen érthető. Lehetséges, hogy L. reuteri egyszerűen az állatállomány védelmét szolgálja az általuk okozott betegségekkel szemben Salmonella typhimurium és egyéb kórokozók. Más tanulmányok azonban ezt feltárták L. reuteri akkor is segíthet, ha a növekedési depressziót teljes egészében az étkezési fehérje hiánya okozza, és nem fertőző betegség. 45 Ez felveti annak lehetőségét L. reuteri valahogy javítja a belek azon képességét, hogy felszívja és feldolgozza a tápanyagokat, és fokozza az étel átalakulását. 46
Végül a Lactobacillus és Bifidobacterium a haszonállatoknak táplált táplálékról kiderült, hogy növeli a napi súlygyarapodást, 55 és ezt a tényt évtizedek óta használják a mezőgazdaságban a takarmány-átalakítás fokozására. Ebben az összefüggésben nem zárható ki, hogy a specifikus probiotikum törzsek orális beadásával járó „növekedésserkentő” hatás hasonló az emberi elhízáshoz kapcsolódó mechanizmusokhoz. Például Abdulrahim et al. 56 arról számolt be L. acidophilus szignifikánsan megnövekedett hasi zsírlerakódás nőstény csirkéknél önmagában adva, és akár 31%, ha cink-bacitracinnal társult. Ezért további vizsgálatok kötelezőek a probiotikumok és a súlyszabályozás közötti kölcsönhatások feltárásában.
Következtetés
Összegzésképpen elmondható, hogy a M. smithii megerősítették, hogy az elhízással jár. Ezenkívül magasabb szintű B. animalis, L. paracasei vagy L. plantarum normál testsúlyhoz társultak, míg a magasabb L. reuteri elhízással társultak, ami az emberi fogyasztásra másutt forgalmazott probiotikus fajok és az elhízás lehetséges kapcsolatára utal. Ezeket az eredményeket óvatosan kell mérlegelni, mert ez a mai napig az első tanulmány, amely összekapcsolja az egyes fajokat Lactobacillus az emberek elhízásával. Ez a kérdés kritikus fontosságú lesz az elhízás, a huszonegyedik századi világméretű járvány kezelésében, különös tekintettel a probiotikumok virágzó piacára.