Teljes cikk Az étrendi kvercetin javítja az egerek kísérleti vastagbélgyulladását a funkció átalakításával

Jelentések

Teljes cikk
Ábrák és adatok
Hivatkozások
Idézetek
Metrikák
Újranyomtatások és engedélyek
PDF

ABSZTRAKT

A gyulladásos bélbetegség (IBD) krónikus bélgyulladásból és szövetek pusztulásából származik, amely a bél megváltozott mikrobiotájára irányuló aberrált immunvezérelt gyulladásos válasz révén alakul ki. Az étrendi beavatkozás vonzó lehetőségsé válik a vastagbélgyulladás terápiájában, mivel az étrend a nyálkahártya immunválaszának meghatározó tényezője. A quercetin (QCN) a legelterjedtebb természetű és az étrendi antioxidáns flavonoidok fő képviselője, amelyről bebizonyosodott, hogy befolyásolja a vastagbélgyulladás progresszióját. A QCN mögöttes mechanizmusa azonban a bél immunmodulációjában továbbra sem tisztázott. Vizsgálatunk bebizonyította, hogy az étrendi QCN részben javíthatja a kísérleti vastagbélgyulladást azáltal, hogy a makrofágok gyulladáscsökkentő hatásait és baktericid képességét modulálja Heme oxigén-1 (Hmox1, HO-1) függő útvonalon keresztül. Azt javasolta, hogy a QCN helyreállíthatja a bélben a gazdaszervezet és a mikroba közötti kapcsolatot a vastagbélgyulladás enyhítése érdekében azáltal, hogy egyensúlyba hozza az enterális makrofágok gyulladásgátló, gyulladáscsökkentő és baktericid funkcióját. Ezért a bél makrofágok működésének modulálása étrendi QCN alkalmazásával az immunológiai hemosztázis helyreállítása és az enterális kommensális flóra egyensúlyának helyreállítása szempontjából potenciális és ígéretes stratégia az IBD terápiában.

Bevezetés

A mikrobiális kolonizáció létfontosságú a bél immunrendszerének fejlődéséhez és homeosztázisához [17]. A bizonyítékok felhalmozódása feltárta a bélmikrobiális ökológia mély változását az IBD-s betegeknél és az egérmodelleken. A bél mikrobiotáját meghatározták az IBD 18–20 kialakulásának kulcsfontosságú hozzájárulójaként. A bélben a kommenzális flóra iránti immunreaktivitást vissza kell állítani a kóros gyulladás megelőzése érdekében [21]. Az érintett immunológiai paraméterek közül a makrofágok együttműködnek a kommenzális flóra iránti tolerancia elősegítésében, miközben lehetővé teszik a kórokozókkal szembeni reaktivitást. Az immunvédelem és a bél mikrobiota és a makrofágok közötti tolerancia egyensúlyhiánya megindíthatja és elősegítheti az IBD hátterében álló kóros folyamatot [22]; ezért a kommensális mikrobiota egyensúlyának helyreállítása és a makrofág funkciók átalakítása hatékony stratégiát jelenthet az IBD kezelésében.

Eredmények

A QCN beadása csökkenti a bélgyulladást a kolitikus egerekben

Online közzététel:

A QCN vastagbélgyulladásra gyakorolt védőhatásainak bemutatására, amelyek a makrofágok immunológiai funkciójának szabályozásából fakadnak, klodronát tartalmú liposzómák (CDL) injektálásával kimerítettük a makrofágokat egér vastagbélekben. A makrofágok in vivo kimerülése részben ellensúlyozta a QCN terápiás hatásait egy T-sejt által kiváltott kolitikus egér modellben a vastagbél tömegének és hosszának arányában (4A. Ábra), a nyálkahártya falvastagságában (4B. Ábra) és a szövettani pontszámban. 4C).

Online közzététel:

A gázközvetítő szén-monoxidot (CO) a stresszre reagáló HO-1 enzim hozza létre, amely makrofágokban nagymértékben indukálódik bakteriális fertőzésre reagálva [38]. In vivo eredményeink alapján feltételeztük, hogy a HO-1/CO útvonal szerepet játszhat a makrofágok QCN-ben fokozott baktérium-kiürítő képességében. Adataink azt igazolták, hogy a QCN az intracelluláris törlés révén fokozta a baktericid aktivitást E. coli a BMDM Scr sejtcsoportban, míg a BMDM Hmox1siRNS sejtcsoportban ezt nem sikerült 5D ábra). Az a tény, hogy a BMDM-ek QCN-erősített baktericid képességét Sn-protoporfirin (SnPP) semlegesítette, ami megakadályozhatta az endogén CO-képződést, megerősítette a CO részvételét a QCN által kiváltott HO-1 útvonalban. 5E. Ábra.

A phagolysosomális érés a makrofágok baktericid aktivitásának indikátora. Annak érdekében, hogy tovább ellenőrizzük a HO-1 képességét a makrofágok QCN által fokozott baktérium-clearance-ének közvetítésére, a BMDM-eket LysoTracker® Red DND-99-vel inkubáltuk, amely egy gyenge bázis, amely áthatja a sejtmembránokat és alacsony pH-jú környezetben protonálva fluoreszkál fagolizoszóma. A PBS kontrollhoz képest a QCN szignifikánsan fokozta a fagolizoszóma képződést a BMDM Scr sejtekben, E. coli, de kudarcot vallottak a BMDM Hmox1siRNS sejtjeivel, amelyekkel megtámadtuk E. coli 5F ábra).

Tekintettel az LP-makrofágok fagocita jellegére és azok jelentős indukciójára QCN-kezelt egerekben, feltételeztük, hogy a QCN-vel kezelt makrofágok fokozni fogják az MLN-ekhez hozzáférő kommenzális baktériumok clearance-ét. Ennek tesztelésére elemeztük ezen egerek MLN-jeit, hogy felmérjük őket a bakteriális transzlokáció jelei szempontjából. Az LB agarlemezeken tenyésztett összes MLN sejtszuszpenzió alacsonyabb számú baktérium jelenlétét mutatta ki egerekben a QCN kezelés után. 5G. Ábra.

Ezek az adatok együttesen azt mutatták, hogy a HO-1 és annak bioaktív terméke, a CO részt vesz a makrofágok QCN által kiváltott baktériumos clearance-ében.

A QCN-vel kezelt makrofágok a HO-1 útvonalon keresztül elnyomják a DSS által kiváltott vastagbélgyulladást

Annak megerősítésére, hogy a HO-1 útvonal részt vesz a QCN kolitisz elleni védőhatásaiban, a QCN vagy PBS-sel kezelt BMDM-eket DSS beadása után az 1. és 4. napon egerekbe vittük. A 6. napon a QCN-vel kezelt BMDM-kel átvitt egerek szignifikánsan védettek voltak a vastagbélgyulladástól, szemben a PBS-sel kezelt BMDM-ekkel átvitt egerekkel. 6A. Ábra) A BMDM Scr-vel ellentétben a BMDM Hmox1siRNS transzferje nem mutatott kimutatható hatást a DSS által kiváltott vastagbélgyulladás modulálására. 6A – 6C). A proinflammatorikus citokinek, az IFN-γ, IL-17A és TNF-α expresszióját a vastagbélben a QCN-nel kezelt BMDM Scr, mint a PBS-sel kezelt BMDM Scr átvitelét követően szabályozták, míg a HO-1 elnémításakor a citokin downreguláció nem volt kimutatható. kifejezés 6D. ábra). Ezenkívül a E. coli kevésbé volt kifejezett a vastagbélben a QCN-kezelt BMDM Scr-rel átvitt egerekből, mint a PBS-sel kezelt BMDM Scr transzfercsoportból. A számok között azonban nincs lényeges különbség E. coli QCN-kezelt és PBS-kezelt BMDM Hmox1siRNS transzfercsoportok között 6E. ábra).

Online közzététel:

Ezért tanulmányunk kimutatta, hogy a QCN javíthatja a kísérleti vastagbélgyulladást, részben a makrofágok gyulladáscsökkentő hatásainak és baktericid aktivitásának HO-1-függő útvonalon keresztüli modulálásával. A QCN diétás beadása a bél immun hemosztázisának és az enterális kommensális flóra egyensúlyának helyreállítására potenciális és ígéretes stratégia az IBD terápiában.

Anyagok és metódusok

Állatok és kezelések

Az OT-II egereket és a C57BL/6 hátterű Rag1 -/- egereket és a C57BL/6 egereket a Nanjing Egyetem Nanjing Biomedical Research Institute-jából (Nanjing, Kínai Népköztársaság) vásároltuk. Az összes állati protokollt a Soochow Egyetem (Szucsou, Kínai Népköztársaság) Intézményi Laboratóriumi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá.

A vastagbélgyulladás kiváltása

A krónikus vastagbélgyulladás adaptív T-sejt transzfer modellje. A T-sejtek által közvetített vastagbélgyulladást Rag1// - egerekben indukáltuk adoptív CD4 + CD25 - CD62L + T sejtek átvitelével, amelyeket FACSAria II áramlási citométerrel rendeztünk (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). A Rag1 -/- recipienseknek 5 × 105 CD4 + CD25 - CD62L + T sejtet kaptunk intraperitoneális injekcióval, és az egereket az átvitel után 6-7 héttel eutanizáltuk. Néhány befogadó egér szájon át 10 mg/testtömeg-kg QCN-t vagy PBS-t kapott 3 naponta egyszer, 7 héten át a CD4 + CD25 - CD62L + T sejtek átvitele után. A betegség aktivitási indexét (DAI) és a szövettani pontszámokat a korábban leírtak szerint határoztuk meg [52–55].

Kémiailag indukált vastagbélgyulladás modell. A vastagbélgyulladást 8-12 hetes C57BL/6J egerekben indukálták 2,5% (wt/vol) DSS (36-50 KD molekulatömeg; MP Biomedicals, Solon, OH, USA) hozzáadásával ivóvízükbe. A BMDM-ek átviteléhez a BMDM Hmox1siRNS-t vagy a BMDM Scr-t 48 órán át bélbaktérium-antigénnel (20 ug/ml) kezeltük PBS vagy QCN jelenlétében. A BMDM-eket intravénásán (3x106) injektáltuk minden recipiens egérbe a DSS-kezelés 1. és 4. napján. A testtömegeket, a széklet konzisztenciáját és a GI vérzését naponta ellenőriztük. Becsültük a klinikai pontszámokat és a vastagbélkárosodás pontszámait, amint azt korábban részleteztük [56]. A vastagbéleket az elpusztítás után azonnal összegyűjtöttük, és a nyálkahártyát lekapartuk az összes RNS vagy fehérje izolálása céljából.

Reagensek, antitestek és áramlási citometria

A QCN-t és az LPS-t a Sigma-Aldrich Co.-tól (St Louis, MO, USA) szereztük be. Az SnPP-t (30 μM) a Frontier Scientific Inc.-től (Logan, UT, USA) vásároltuk. Fluorokrómmal jelölt antitesteket a Biolegend-től vásároltunk, hacsak másképp nem jelezzük: IL-17A (TC11–18H10.1; eBioscience, San Diego, CA, USA); anti-IL-4 (11B11); anti-IL-10 (JES5–16E3, eBioscience); anti-IFN-y (XMG1.2), anti-Foxp3 (FJK-16s, eBioscience); anti-CD11b (M1/70); anti-CD4 (RM4-5); anti-CD3 (145-2C11); anti-Gr-1 (RB6-8C5); anti-Ly6G (1A8); és anti-CD45 (30-F11). A felületi markerek elemzéséhez a sejteket 2% (tömeg/térfogat) BSA-t tartalmazó PBS-ben festettük. A sejteket megfelelő antitestkeverékkel festettük. Az intracelluláris citokinek kimutatásához a sejteket először 4 órán át stimuláltuk 50 ng/ml PMA-val és 1 ng/ml ionomicinnel Brefeldin A jelenlétében (5 µg/ml; mindezt a Sigma-Aldrich Co.-tól kaptuk), amelyet a felületi markerek festése követ. A sejteket ezután rögzítettük és permeabilizáltuk a Foxp3 Fix/Perm pufferkészlet (eBioscience) segítségével, és festettük intracelluláris citokinekre. Az áramlási citometriás adatokat FACSCalibur-on (BD Biosciences) gyűjtöttük, és a FlowJo szoftver segítségével elemeztük (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). A sejtek szortírozását FACSAria II alkalmazásával hajtottuk végre.

Szövettan és immunhisztokémia

A szövetmintákat 10% -os formalinban rögzítettük, dehidratáltuk, majd paraffinba ágyazottuk; 2–4 μm vastag szakaszokat festettünk hematoxilinnal és eozinnal. Az immunfluoreszcencia-analízishez a szöveti metszeteket antigén-visszakeresésnek vetettük alá, a tárgylemezeket Antigen Unmasking Solution-ban (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 10 percig forralva a gyártó utasításainak megfelelően. Ezután a metszeteket 1 órán át 22 ° C-on blokkoltuk 5% BSA-val PBS-ben, és inkubáltuk a Ki67 (eBioscience), az egér monoklonális anti-E-kadherin, anti-CD11c, F4/80 és CD11b (BD Biosciences) elleni antitestekkel, és 1/250 hígításban használtuk, majd Alexa488-konjugált anti-kecske immunglobulin (Ig) G vagy Alexa594-jelölt anti-nyúl IgG (1: 600; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A szöveteket DAPI-val ellenfestettük, és a képeket Leica SP5 II konfokális mikroszkóppal (Leica Microsystems, Wetzlar, Németország) készítettük. A dendritikus sejtek vagy makrofágok immunhisztokémiai elemzéséhez az OCT (Sakura Finetek) beágyazott szöveti kriosekciókat (5 μm vastagsággal) CD11c-vel vagy F4/80-mal (BM8; eBioscience) festettük.

A baktériumok 16S rDNS genetikai elemzése

A QCN-vel kezelt és kezeletlen egerek vastagbéltartalmából DNS-t extraháltunk, és kvantitatív valós idejű PCR-rel elemeztük általános 16S rDNS-primerek (ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT és ATTACCGCGGCTGCTGGC) felhasználásával. A 16S rDNS relatív bőségét minden megcélzott baktériumcsoportra ΔCT módszerrel számítottuk ki, és a mintában lévő összes 16S rDNS mennyiségére normalizáltuk.

RNS extrakció és PCR

A teljes RNS-t izolált vékonybél hámsejtekből állítottuk elő az RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) felhasználásával, a gyártó utasításainak megfelelően. A teljes RNS-t (1 μg) reverz transzkripciónak vetettük alá véletlenszerű hexamerek és Superscript II (Invitrogen) alkalmazásával, majd kvantitatív PCR-analízissel. Az érdekes gének számszerűsítéséhez a cDNS-mintákat egy LightCycler 480 valós idejű PCR rendszerben (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország) SYBR Green Master Mix (Invitrogen) és specifikus primerekkel (1. kiegészítő táblázat) amplifikáltuk, a gyártó utasításainak megfelelően. . Az mRNS expressziójának változásait a kezelések és a kontrollok között ΔCT módszerrel határoztuk meg, a leírtak szerint [57]. A diagramokon található hibasávok az átlag ± standard hibáját (SEM) jelentik, hacsak másképp nem jelezzük. Az adatokat GAPDH referenciára normalizáltuk. Az összes alapozót a Sangon Biotech-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk.

ELISA

Az IL-17A, IL-6, TNF-a, IL-10 és IFN-y (eBioscience) mennyiségét a tenyészet felülúszójában, a vékonybélben és a vastagbélben határoztuk meg ELISA kitek alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően. A vizsgálat érzékenysége 5 makrofág volt, és 8 × 105 OT-II T-sejtet tovább összekevertek rokon peptid (5 μg/ml; OVA) jelenlétében. Négy napos tenyésztés után az élő T-sejteket összegyűjtöttük és PMA-val (phorbol 12-mirisztát-13-acetát; 50 ng/ml) és ionomicinnel (1 ng/ml; Sigma-Aldrich Co.) plusz brefeldin A-val (10 ng/ml) stimuláltuk. ml; Sigma-Aldrich Co.) intracelluláris citokin festésre vagy mRNS elemzésre. Az mRNS-t valós idejű PCR-rel értékeltük, és felülúszókat használtunk a citokin-méréshez ELISA-val.

Lamina propria limfociták (LPL) izolálása

Az LPL-k elkülönítésére használt módszert korábban leírták [58]. Röviden: a zsírszöveteket és a PP-ket eltávolították a vékonybélből. A beleket kinyitottuk és 1 cm hosszú darabokra vágtuk, és 5 mM EDTA-t és 10 mM Hepes-t tartalmazó HBSS-oldatban inkubáltuk 30 percig 37 ° C-on, lassú forgatással (180 fordulat/perc/-1). A darabokat ezután tovább vágtuk és HBSS oldatban inkubáltuk, amely 0,5 mg ml -1 DNáz I-t (Roche, Basel, Svájc) és 1 mg/ml -1 IV típusú kollagenázt tartalmazott (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA). Végül az emésztett szövetet tartalmazó oldatot 100 μm-es sejtszűrőn átengedtük, és az LPL-ket kinyertük a 40% -os és 80% -os Percoll (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) oldatok határfelületén. Az áramlási citometriás elemzéshez a sejteket standard eljárásokkal jelöltük, a fentiek szerint.

A bélbaktériumok antigénjeinek izolálása in vitro sejttenyésztéshez

A friss ürüléktartalmat összegyűjtöttük és gondosan újraszuszpendáltuk PBS-ben (0,01 g/ml). A kapott szuszpenziót 400xg sebességgel 5 percig centrifugáltuk, hogy a nagyobb részecskét eltávolítsuk a baktériumokból. A baktérium-szuszpenziókat ezután ultrahanggal történő fizikai megszakítással lizálták. A lizátum fehérje koncentrációját a Bradford fehérje esszével számszerűsítettük. 20 µg/ml teljes GBA-t használtunk in vitro stimulációhoz.

Western blot elemzés

A Western-blotot standard protokollokkal, BMDM-ek vagy vastagbélszövet alkalmazásával végeztük. A nyúl anti-egér HO-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), nyúl antifigment Nrf2 poliklonális antitest (Santa Cruz Biotechnology), nyúl monoklonális anti-GAPDH antitest (D16H11, Cell Signaling Technology, Danverset, MA, USA) és β-aktint (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) használtunk. A blotokat háromszor 30 percig TBST-ben mostuk, torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel inkubáltuk (1: 5000 hígítás; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) 20 percig, háromszor mostuk TBST-ben, és fokozott kemilumineszcenciával tettük láthatóvá.

BMDM-ek generálása

Az egér makrofágjainak előállításához az egerek combcsontjaiból és sípcsontjaiból csontvelő sejteket gyűjtöttünk, és hat lyukú szövettenyésztő lemezeken (Costar) tenyésztettünk 8 napig teljes tápközegben, 20 ng/ml M-CSF-el kiegészítve. PBS-t vagy QCN-t adtunk néhány üreghez az 5. naptól kezdve.

Kis interferáló RNS transzfekció

A BMDM-eket Hmox1 kis interferáló RNS-sel (siRNS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) transzfektáltuk lipofektamin RNAiMAX transzfekciós reagens (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával. A kontroll kódolt siRNS-t a Thermo Fisher Scientific cégtől vásároltuk.

Phagolysosomális savanyítási vizsgálat

A WT egerekből származó BMDM-eket SnPP-vel (30 μM) inkubáltuk 1 órán át. A sejteket ezután LysoTracker Red DND-99-vel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kezeltük 100 nmol/l koncentrációban 30 percig, valamint E. coli 1 órán át 4% paraformaldehidben rögzítve és Topro-3 magfestettel (5 nmol/L; Invitrogen) festettük. A sejteket konfokális mikroszkóppal, Leica SP5 II (Leica Microsystems) konfokális mikroszkóppal tettük láthatóvá. Legalább 10 nagy teljesítményű mezőt és 100 cellát számláltak.

Gentamicin védelmi vizsgálat

A BMDM-eket (1 × 106) PBS vagy QCN jelenlétében tenyésztettük, majd E. coli 10: 1 arányban antibiotikummentes tápközegben 1 órán át. A sejteket ezután PBS-sel és gentamicinnel (200 μg/ml) mostuk, és gentamicinnel (200 μg/ml) kiegészített táptalajban inkubáltuk 37 ° C-on további egy órán át az extracelluláris baktériumok eltávolítása érdekében. Új sejteket adtunk gentamicinnel (100 μg/ml) a sejtekhez. Néhány kísérletben SnPP-t (30 μM) adtak a sejtekhez az extracelluláris baktériumok eltávolítását követően. A sejteket 1% Triton X-100-mal lizáltuk, hígítottuk, agyi szívinfúziós agar lemezekre szélesztettük és 37 ° C-on inkubáltuk. Az 1 órával számított kolóniaképző egységek (CFU-k) a baktériumok teljes felvételét (fagocitózis) tükrözték. A 12 órával kinyert CFU-k a fagocitizált összes baktérium százalékos túlélését jelentik az 1 órás időpontban.